[发明专利]一种生产柚苷酶的方法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种生产柚苷酶的方法，属于微生物发酵技术领域。 

技术背景

    柚苷酶是一种重要的用于果汁里苦味物质水解的酶，是由α-L-鼠李糖苷酶（α-L-rhamnosidase，EC 3.2.1.40）与β-D-葡萄糖苷酶（β-D-glucosidase，EC3.2.1.21）组成的一种糖苷水解复合酶系，同时具有 α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶两种酶的活性，柚苷酶可以作用于有苦味的柚皮苷并将其水解产生黄酮类物质，过程是柚皮苷先在α-L-鼠李糖苷酶作用下生成鼠李糖及普鲁宁（Prunin，又译作樱桃苷），普鲁宁的苦味约为柚皮苷的三分之一，因此苦味有所减轻，然后普鲁宁可在β-D-葡萄糖苷酶的作用下被分解为无苦味的柚皮黄酮物质（主要为柚皮苷）。柚苷酶的微生物来源方面主要集中在霉菌（黑曲霉和青霉等），细菌产柚苷酶的相关报道较少。 

我国是柑橘生产大国，但是目前在柑橘果汁的加工行业主要问题就是果皮的深加工利用问题。在被当作垃圾大量处理掉到的柑橘皮含有丰富的柚皮黄酮 ( 主要为柚皮苷)， 果胶，膳食纤维等，如能将其充分利用，不仅能够减轻环境压力，还可以造福于人类。现代药理学研究发现，柚皮黄酮具有多种生理活性：可调节毛细血管的脆性与渗透性，保护心脏，有抗溃疡、解毒、利尿、抗菌、消炎清热等功效, 也是一种高效的天然抗氧化剂, 是一种天然的保健产品。 因此柚皮的深加工将大幅提高果农的收入，提高柚子的附加值等。 

虽然对柚苷酶的研究越来越深入，但目前仅有少数柚苷酶的生产实现了工业化，目前限制柚苷酶的大规模工业化应用方面存在两个问题：第一个主要问题是我国缺乏适合工业化生产的高产酶菌株，这就极大限制了应用，高产柚苷酶菌株的培育困难之处在于如何在大量的诱变后代中将优秀突变株高效率的选出 ，到目前为止尚无较好的办法，菌株的选育进展缓慢，发展出新的高效的筛选方法很有必要，因此对高产菌株的培育是目前的当务之急。第二个问题是柚苷酶的固定化技术在国内还存在着很多的缺陷，在固定化中使用的试剂或载体存在成本偏高、固定化效率低下、稳定性较差、连续操作使用的设备较复杂等，这就需要我们国家进一步开发出更简便同时更适用的固定化方法，柚苷酶应用于柑桔及其他制品的脱苦与加工国外已有相关报道，但在我国柚苷酶并没有大规模的在生产中应用，主要原因是国内尚无规模制备的商品柚苷酶出售，今后我们应加强关于选育高产柚苷酶菌株的方法，并制备出低成本的柚苷酶纯酶，具有重要的实际意义。 

与霉菌（黑曲霉和青霉等）液体发酵产柚苷酶相比，细菌液体发酵生产柚苷酶具有生长周期短、生产成本低、易于控制生长条件等诸多优点，近几年得到研究者更多的关注。但是，细菌生产的柚苷酶活性和霉菌相比，还具有一定的差距；目前所报道细菌发酵产酶水平不超过1000 U单位每毫升发酵液；细菌发酵产柚苷酶最适作用温度偏中性环境可能限制其在酸性环境中的部分应用。 

发明内容

本发明通过创造性劳动，培养出了一种能够产柚苷酶的解淀粉芽孢杆菌；进而提供了一种用解淀粉芽孢杆菌生产柚苷酶的方法。本发明的解淀粉芽孢杆菌产的柚苷酶，分子量为32.5 kDa，最适宜作用温度、pH分别为45℃、7.5。本发明的解淀粉芽孢杆菌产的柚苷酶与本发明之前的由细菌和霉菌生产的柚苷酶相比，存在以下特殊之处：从解淀粉芽孢杆菌11568中产柚苷酶的部分酶学性质（最适pH和pH值稳定性、最适温度和温度稳定性）等研究，表明其在产业化应用前景的果汁脱苦等领域有极大应用前景，在提高葡萄酒的风味、改善饮料的香气成分和生产食品添加剂中也起到重要作用，对柚苷酶的分离纯化及性质的研究为制备出更好的在工业上应用的商品酶提供重要依据。 

本发明的技术方案 

本发明提供了一种新的生产柚苷酶的方法。

一种生产柚苷酶的方法，包括以下步骤： 

（1）将保藏号为CGMCCNo.9928的解淀粉芽孢杆菌11568进行斜面培养，得斜面菌种；

（2）取斜面菌种接种到已灭菌的种子培养基中，在40.9℃、180rpm的条件下发酵培养48h，得液体发酵液；

（3）离心分离液体发酵液，取上清液；

（4）上清液经过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析，得到柚苷酶。