[发明专利]转基因玉米的多重PCR筛查检测引物及检测方法

说明书

技术领域

 本发明属于生物技术领域，涉及一种可同时检测两种和六种外源基因的多重PCR筛查检测方法。

背景技术

目前关于进口转基因玉米及其产品的筛查检测技术，主要集中在单一基因PCR方法，尚无关于检测进口转基因玉米及其产品的多重PCR筛查检测策略研究及相关筛查检测技术。

发明内容

本发明的目的主要是提供一种准确、快速、简便的多重PCR快速筛查多个目的基因元件的检测方法。

本发明通过下述技术方案实现：

转基因玉米的多重PCR筛查检测引物，包括以下引物序列：

其中，二重PCR引物序列如下：

P-CaMV 35S-F：5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3'；

P-CaMV 35S-R：5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3'；

T-NOS-F：5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3'；

T-NOS-R：5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3'。

六重PCR引物序列如下：

P-ract1-F：5'-AGTCCAAAATAAAACAAAGGTAAGAT-3'；

P-ract1-R：5'-TTCACTTTGGGCCACCTTT-3'；

T-NOS-F：5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3'；

T-NOS-R：5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3'；

P-CaMV 35S-F：5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3'；

P-CaMV 35S-R：5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3'；

bar-F：5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3'；

bar-R：5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3'；

pat-F：5'-GAAGGCTAGGAACGCTTACGA-3'；

pat-R：5'-CCAAAAACCAACATCATGCCA-3'；

PMI-F：5'-TTCTGAAATCGGTTTTGCCAA-3'；

PMI-R：5'-TCAGCAATAGCGGGGAGAA-3'。

上述二重PCR检测方法如下：

（a1）合成以下引物：

P-CaMV 35S-F：5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3'；

P-CaMV 35S-R：5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3'；

T-NOS-F：5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3'；

T-NOS-R：5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3'；

（a2）制备待测玉米的DNA稀释液；

（a3）配制PCR反应体系；

（a4）进行PCR反应；

（a5）取PCR反应产物进行毛细管电泳。

进一步地，步骤（a3）中所述的配制PCR反应体系总体积为25μL；具体含以下组分：PCR Master Mix（2X）、DNA稀释液、步骤（a1）中的各引物、ddH₂O；其中PCR Master Mix（2X）的加入量为12.5μL，DNA稀释液加入量为2.0μL，各引物加入后的终浓度均为0.2μM，采用ddH₂O补足25μL。

再进一步地，所述PCR反应条件为：94℃变性5min，然后进入35个循环；94℃30s，58℃30s，72℃30s；循环结束后72℃延伸5min。

上述六重PCR检测方法如下：

（b1）合成以下引物：

P-ract1-F：5'-AGTCCAAAATAAAACAAAGGTAAGAT-3'；

P-ract1-R：5'-TTCACTTTGGGCCACCTTT -3'；

T-NOS-F：5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3'；

T-NOS-R：5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3'；

P-CaMV 35S-F：5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3'；

P-CaMV 35S-R：5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3'；