[发明专利]利用大肠杆菌表达系统获得可溶性胰岛素原的方法

说明书

技术领域

本发明涉及可溶性胰岛素原制备技术领域，特别是涉及一种利用大肠杆菌表达系统获得可溶性胰岛素原的方法。 

背景技术

糖尿病（Diabetes mellitus, DM）是多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱，是由于体内胰岛素绝对或相对缺乏或靶组织对胰岛素不敏感而引起的综合病症，是环境和遗传两个因素长期共同作用的结果。根据世卫组织（WHO）预测，2020年以后全世界糖尿病患者人数可能突破4个亿。糖尿病因其病因复杂，并发症多，治愈率低，成为国际国内一大医学难题，也带来了严重的经济和社会问题，被WHO称为不死的癌症。糖尿病的治疗药物有很多种，胰岛素在糖尿病治疗中具有无可替代的作用和地位，是最直接最有效的治疗糖尿病药物之一，胰岛素制剂现在已占到了整个糖尿病用药30%以上的市场份额。

人胰岛素（human-insulin, HIN）是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的激动而分泌的一种蛋白质激素。在人的β细胞细胞核中，第11对染色体短臂上胰岛素基因区DNA向mRNA转录，mRNA在内质网上翻译成前胰岛素原（Preproinsulin）；前胰岛素原通过内质网膜时，被信号肽酶切去N端信号肽，生成胰岛素原（Proinsulin，PI），同时PI分子内形成3个二硫键；PI随胞浆中的微泡进入高尔基体，经蛋白水解酶的作用，断裂生成没有作用的C肽，同时生成胰岛素（Insulin）分泌到β细胞外，进入血液循环作为一种激素行使降血糖的功能。

人的Preproinsulin由110个氨基酸残基组成。由N端至C端连接顺序为S-B-Arg-Arg-C-Lys-Lys-A，其中S：signal peptide信号肽，24个氨基酸残基；C：C肽，31个氨基酸残基，不同种属动物的C肽不同；A和B分别为胰岛素的A链（21个氨基酸）和B链（30个氨基酸）。整个PI分子含有3 对二硫键, 其中2 对链间二硫键( A6－B6, A20－B19) 位于B 链和A 链之间，1 对链内二硫键( A6－A11) 位于A 链内部。

早期用于临床的Insulin几乎都是从猪、牛胰脏中提取的。由于Insulin需求量巨大，促使人们不断改进工艺和采用新的技术成果生产Insulin。DNA重组技术的出现为Insulin的生产开创了新的途径。近几十年来，基于对Insulin分子结构及功能更加深入的了解，人们不仅实现了人胰岛素在大肠杆菌（Escherichia coli）中的生物合成并推向市场，而且PI及其类似物基因在许多系统如毕赤酵母（Biotechnol Appl Biochem, 1999, 29:78-86; Biotechnol Bioeng, 2001,73:74-79）、酿酒酵母（Appl Microbiol Biotechnol, 2000, 54: 277-286; J Biol Chem, 2002, 277: 18245-18248）、哺乳动物细胞（Sci Rep, 2014, 4: 6465）、转基因植物（Nat Biotechnol 1998,16:934-938; Plant Biotech J, 2006, 4: 77-85; Plant Biotech J, 2011, 9: 585-598; Genet Mol Res, 2010, 9 :1163-1170; Jundishapur J Nat Pharm Prod, 2014, 9: 9-15）中都得到了表达。现在上市的基因工程Insulin主要有2种生产工艺，分别为美国礼来公司（Eli Lilly and Company）的E.coli表达系统和丹麦诺和诺德公司（Novo Nordish）的酵母表达系统。1998年12月，我国通化东宝药业利用E.coli表达系统生产的重组HIN填补了我国能够生产及销售重组Insulin药物的空白，成为中国最大的重组HIN生产厂家。