[发明专利]利用大肠杆菌表达系统获得可溶性胰岛素原的方法

权利要求书

1.一种利用大肠杆菌表达系统获得可溶性胰岛素原的方法，其特征在于，

（1）对人源PI基因进行了密码子优化，合成了经过密码子优化的基因；

（2）设计引物，PCR扩增后，将经过密码子优化的基因融合TrxA蛋白构建融合表达载体；

（3）转入大肠埃希氏菌NKYBYP表达菌株，发酵； 

（4）将发酵后的菌体超声破碎，分离纯化上清液中TrxA-PI融合蛋白； 

（5）融合蛋白经肠激酶酶切、亲和层析纯化后获得PI纯品。

2.根据权利要求1所述的利用大肠杆菌表达系统获得可溶性胰岛素原的方法，其特征在于，步骤（1）中将人源PI基因的密码子优化为E.coli 偏爱密码子，经过密码子优化的基因序列为：

ATGGCACTGTGGATGCGTCTGCTGCCGCTGCTGGCCCTGCTGGCCCTGTGGGGTCCGGATCCAGCCGCAGCATTCGTTAATCAGCATCTGTGTGGCAGCCATCTGGTGGAAGCGCTGTATCTGGTTTGCGGTGAACGTGGCTTTTTCTATACCCCGAAAACCCGTCGTGAAGCGGAAGATCTGCAGGTGGGCCAGGTGGAACTGGGTGGCGGTCCAGGCGCAGGCAGCCTGCAGCCACTGGCGCTGGAGGGCAGCCTGCAAAAGCGTGGCATTGTGGAACAGTGCTGCACCAGCATTTGTAGCCTGTATCAGCTGGAAAACTATTGTAAT。

3. 根据权利要求1所述的利用大肠杆菌表达系统获得可溶性胰岛素原的方法，其特征在于，步骤（2）中设计引物，含NcoI 和Xho I酶切位点的引物如下：

5’-3’ ATCCATGGCATTCGTTAATCAGCATCTGTGTG

3’-5’ CGCGCTCGAGTTATCAATTACAATAGTTTTCCAGC

以合成的含PI基因的质粒为模板， PCR扩增获得经过密码子优化的PI基因。

4.根据权利要求1所述的利用大肠杆菌表达系统获得可溶性胰岛素原的方法，其特征在于，步骤（2）中，PCR产物用限制性内切酶NcoI 和Xho I 酶切后，连接到被同样酶切过的表达载体pET-32a上，构建融合表达载体pET-32a-PI。

5.根据权利要求1所述的利用大肠杆菌表达系统获得可溶性胰岛素原的方法，其特征在于，步骤（3）中所述大肠埃希氏菌Escherichia coli NKYBYP，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是：CGMCCNo.9979，保藏日期为2014年11月17日。

6.根据权利要求1所述的一种利用大肠杆菌表达系统获得可溶性胰岛素原的方法，其特征在于，步骤（3）中发酵过程为:

①将测序验证后的质粒转入菌株大肠埃希氏菌NKYBYP，挑取平板上的单克隆至LB培养基中培养，培养基中添加终浓度100 μg/ml的Amp、15 μg/ml的Kan，12.5 μg/ml的Tet，34 μg/ml的Chl；

②将步骤①培养好的菌液按1%接种量接种至扩大培养基中，37℃，200 rpm扩大培养；

③当OD₆₀₀＝0.8时加入终浓度0.2 mM IPTG，在25℃，160 rpm诱导8 h。

7.根据权利要求1所述的利用大肠杆菌表达系统获得可溶性胰岛素原的方法，其特征在于，步骤（4）中11000 rpm离心2分钟收集菌体，用三蒸水洗涤菌体2次，加入Binding buffer溶解菌体，超声破碎，超声破碎条件：功率350瓦，超声5秒，间隔10秒，超声30次直至菌体澄清；11000 rpm离心10分钟，从上清液中提取融合蛋白。

8.根据权利要求7所述的利用大肠杆菌表达系统获得可溶性胰岛素原的方法，其特征在于，Binding buffer为0.5 M NaCl,20 mM Tris-HCl,5 mM imidazole,pH 8.0。