[发明专利]一种干巴菌菌种的分离培养方法

权利要求书

1.一种干巴菌菌种的分离培养方法，其特征在于包括采样、表面灭菌、分离及纯培养步骤，具体包括：

A、采样：在云南松林地中选择生长4~7天以内的干巴菌子实体进行采样并进行保藏；

B、表面灭菌：将采集的干巴菌子实体进行表面灭菌处理；

C、分离及纯培养：将灭菌处理后的干巴菌子实体掰开，切取0.1~0.2cm的干巴菌子实体置入由马铃薯150~250g、葡萄糖10~30g、琼脂20~30g、蛋白胨5~7g、松树皮和/或松毛40~60g、磷酸二氢钾2~4g、硫酸镁4~6g制备得到的干巴菌组织分离培养基的培养基平面或试管斜面中，于20~26℃下避光培养36~72h，再接种至由棉籽壳或荞籽0~70g、松木屑和/或松毛30~50g、麸皮0~15g、包谷芯和/或包谷面0~40g、石膏粉0.5~1.5g制备得到的干巴菌固体培养基的培养基平面或试管斜面中，于20~26℃下避光培养6~8天得到目标物，移入干巴菌固体培养基的试管斜面保存。

2.根据权利要求1所述的干巴菌菌种的分离培养方法，其特征在于A步骤中所述的保藏为密封0~4℃低温保藏。

3.根据权利要求1所述的干巴菌菌种的分离培养方法，其特征在于A步骤所述的保藏的时间为8~24h。

4.根据权利要求1所述的干巴菌菌种的分离培养方法，其特征在于B步骤中所述的表面灭菌处理是用65~75%的酒精进行表面消毒灭菌处理。

5.根据权利要求1所述的干巴菌菌种的分离培养方法，其特征在于C步骤中所述的干巴菌组织分离培养基由马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂25g、蛋白胨6g、松树皮和/或松毛50g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁5g制备得到，pH值为6.5~7.5，其制备方法如下：

A、前处理：将马铃薯洗净去皮，按配方比例称取，切成0.4~0.6cm片，加固液体积比1~3倍的水于95~110℃煮4~6min，用双层纱布过滤得到滤液a；按配方比例称取松树皮和/或松毛，加固液体积比2~5倍的水于95~100℃下熬煮4~10min，过滤，得到滤液b； 

B、配制：合并滤液a和滤液b，于95~110℃下加入配方比例的琼脂粉、葡萄糖、蛋白胨、KH₂PO₄和MgSO₄，用玻璃棒搅拌融化，移入试管或培养皿中，于压力1.5Kg/cm²、温度121~126℃灭菌30~40min制备得到。

6.根据权利要求1所述的干巴菌菌种的分离培养方法，其特征在于C步骤中所述的干巴菌固体培养基由棉籽壳50g、松木屑35g、麸皮14g和石膏粉1g制备得到，pH值为6.5~7.5，其制备方法如下：

A、前处理：按配方比例称取棉籽壳，加入固液体积比2~4倍的水于20~26℃下浸泡18~30h，过滤，得到滤液c；

B、配制：在滤液c中加入配方比例的松木屑、麸皮和石膏粉，拌匀并调节含水量为60~65%，移入菌种瓶或塑料袋中，封口，于1.5Kg/cm²、温度121~126℃灭菌100~140min制备得到。

7.根据权利要求1所述的干巴菌菌种的分离培养方法，其特征在于C步骤中所述的干巴菌固体培养基由松木屑30g、松毛20g、麸皮10g、包谷芯30g、包谷面9g和石膏粉1g制备得到，pH值为6.5~7.5，其制备方法如下：

A、前处理：按配方比例称取包谷芯和松毛，加入固液体积比2~3倍的水于20~26℃下浸泡24~48h，过滤得到滤液d；

B、配制：在滤液d中加入配方比例的松木屑、麸皮、包谷面和石膏粉，拌匀并调节含水量为60~65%，移入菌种瓶或塑料袋中，封口，于1.5Kg/cm²、温度121~126℃灭菌100~140min制备得到。

8.根据权利要求1所述的干巴菌菌种的分离培养方法，其特征在于C步骤中所述的干巴菌固体培养基由荞籽70g、松木屑29g和石膏粉1g制备得到，pH值为6.5~7.5，其制备方法如下：

A、前处理：按配方比例称取荞籽，加入固液体积比2~3倍的水于20~26℃下浸泡40~72h，过滤得到滤液e；

B、配制：在滤液e中加入配方比例的松木屑和石膏粉，拌匀并调节含水量为60~65%，移入菌种瓶或塑料袋中，封口，于1.5Kg/cm²、温度121~126℃灭菌100~150min制备得到。