[发明专利]一种碱性木聚糖酶突变体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于功能基因改造技术领域，具体涉及一种碱性木聚糖酶突变体及其应用。

技术背景

木聚糖酶(Xylanase)是指能专一降解半纤维素木聚糖为低聚木糖和木糖的一组酶的总称。它在饲料、烘焙、啤酒、造纸、纺织、医药及能源等领域得到了日益广泛的应用。特别在纸浆漂白工艺中，木聚糖酶的应用能够降低含氯化合物的用量，促使纸浆中残余木质素的降解和溶解性木质素的抽除，不但可以提高纸浆的白度和白度稳定性，改善纤维的滤水性和造纸性能，而且可以降低后续工艺化学物质的用量，减少富含氯化物的工业废水的排放，对有效降低环境污染，解决严重困扰造纸业的污染问题具有极大的现实意义。

目前，以无元素氯和全无氯漂白工艺为代表的纸浆漂白已经成为世界各国造纸业纸浆漂白发展的必然趋势，木聚糖酶酶法助漂新工艺已在欧洲和北美的30余家大型纸厂得到应用，丹麦诺维信公司等多家酶制剂厂商，纷纷推出了专门用于纸浆漂白的木聚糖酶和纤维素酶新产品。但目前为止，工业上用的木聚糖酶主要来自细菌和真菌，报道较多及产酶活力较高的微生物主要是黑曲霉、木霉和青霉等真菌，它们所产的酶大多为中性偏酸的木聚糖酶，最适反应温度大多在50℃以下。而在造纸工业中，纸浆蒸煮和漂白工艺基本都是在高温和强碱的条件下进行，使得现有的酸性或中性木聚糖酶产品受到了极大的限制。因此，研究开发具有优良特性的碱性木聚糖酶具有重大经济效益和社会效益，具有更广的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种碱性木聚糖酶突变体及其应用。本发明通过对来源于芽孢杆菌(Bacillus Sp.)的木聚糖酶进行蛋白质工程改造，获得了突变体蛋白，其耐热性、最适反应pH得到显著提高，有利于其在造纸领域的广泛应用。

申请人对芽孢杆菌木聚糖酶进行突变，经过大量的筛选，发现Q65R、F80Y、E82T、K162H、A218S、L332H这六个突变位点能引起木聚糖酶耐热性、最适反应pH的改变，从而促成本发明。

本发明一方面提供了一种木聚糖酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的木聚糖酶的第65位氨基酸由Gln变为Arg，第80位氨基酸由Phe变为Tyr，第82位氨基酸由Glu变为Thr，第162位氨基酸由Lys变为His，第218位氨基酸由Ala变为Ser，第332位氨基酸由Leu变为His。

上述木聚糖酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。

本发明另一方面提供了携带有编码序列为SEQ ID NO：4的木聚糖酶突变体基因的质粒。

将上述质粒转入毕赤酵母中进行重组表达，获得的木聚糖酶突变体耐热性、最适反应pH得到很大提高。

本发明提供的木聚糖酶突变体XynT6最适pH值为9.0，在pH7.0-10.0范围内能保持75％以上的酶活，且突变体在碱性条件下的酶活性水平明显高于野生型；木聚糖酶突变体XynT6的最适作用温度为60℃，且在65℃条件下仍能保持80％左右的酶活，比野生型具有更强的耐热性。本发明提供的木聚糖酶突变体XynT6，能有效提高纸浆的白度，有利于造纸企业改进纸浆漂白工艺，减少化学漂白剂的使用，减轻环境污染，应用前景广阔。

附图说明

图1为SDS-PAGE电泳图；

其中：M为蛋白分子量Marker，泳道1为转空载体对照菌，泳道2为毕赤酵母XynT6发酵粗酶液；

图2为木聚糖酶突变体XynT6的发酵曲线；

图3为木聚糖酶突变体XynT6与野生型XynA1的最适作用pH比较图；

图4为木聚糖酶突变体XynT6与野生型XynA1的最适作用温度比较图。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。

实施例1 木聚糖酶基因的扩增