[发明专利]一种从花椒内生耐寒短杆菌发酵液中制备L-酪氨酸的方法

权利要求书

1.一种从花椒内生耐寒短杆菌发酵液中制备L-酪氨酸的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

(1)微生物菌种及培养基

菌种：由中国典型培养物保藏中心保藏的一株花椒内生耐寒短杆菌属GH-HJZ2(Brevibacterium frigoritolerans GH-HJZ2，保藏编号为：CCTCC M2013422)菌株，培养条件为划线接种到斜面培养基上，于温度30℃恒温培养箱中培养24h后，将获得的菌落接种一个单菌落到150mL发酵培养基中，在温度28～37℃下，120～180r/min的水浴恒温振荡器上振荡培养24～72h；

其中，耐寒短杆菌斜面培养基为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，初始pH值7.2～7.4；

发酵培养基为：1％可溶性淀粉，3.5％黄豆粉，1％NaCl，初始pH值7.0；

(2)发酵生产

用上述菌种及培养方法将花椒内生耐寒短杆菌属GH-HJZ2(Brevibacterium frigoritolerans GH-HJZ2，保藏编号为：CCTCC M2013422)发酵获得发酵液；

(3)发酵产物预处理

将上述发酵液用低速离心机在常温下以4000～6000r/min的速度离心15min后除去菌体，然后收集上清液，真空冷冻干燥后备用；

(4)Sephadex LH-20柱分离

将上述发酵液过Sephadex LH-20层析柱，按样品与Sephadex LH-20质量比1:20～50的比例上样，上样量为柱体积的20％；用100mL纯水进行等梯度洗脱，洗脱流速为2～6mL/min；按每份收集量20mL等份收集洗脱液，编号F₁～F₅备用；

(5)物质纯化

将组分F₃用制备型液相色谱仪(pre-HPLC)进行分离纯化，条件如下：GL-science色谱柱(20×250mm,5μm)，流速18.9mL/min，柱温25℃，紫外检测波长280nm，进样量2mL，20％甲醇溶液洗脱30min，收集保留时间为3.8min的色谱峰，冷冻干燥即得L-酪氨酸，得率为8～15mg/L，其结构式如下：