[发明专利]一种脱细胞板层角膜基质片的制备方法

权利要求书

1.一种脱细胞板层角膜基质片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，取新鲜动物眼球进行消毒；

步骤二，消毒后用蘸有酒精的滤纸处理，然后擦除去净上皮细胞层；

步骤三，在手术显微镜下做角膜缘切口，伸入虹膜恢复器分离前层角膜，分离完全后用角膜剪剪下前层角膜；

步骤四，用角膜环钻取出板层角膜；

步骤五，将新鲜板层角膜经过血清浸泡，然后将浸泡后的板层角膜基质片进行漂洗或冰浴电泳处理；

步骤六，将漂洗或电泳处理完毕的板层角膜基质片进行梯度脱水，即得到未干燥板层组织工程角膜支架，采用环氧乙烷灭菌处理，保存备用；

步骤七，将未干燥角膜基质片放于24孔板内进行干燥，得到干燥脱细胞板层角膜；

步骤八，将干燥后的样品进行钴60消毒，进行复水处理，得到复水板层角膜基质片，即得所述的板层组织工程角膜基质支架，保存备用。

2.根据权利要求1所述的一种脱细胞板层角膜基质片的制备方法，其特征在于：在步骤一中，将新鲜动物眼球采用碘伏浸泡或含抗菌素的PBS浸泡的方式进行消毒，浸泡后采用PBS冲洗三次，每次冲洗5min。

3.根据权利要求1所述的一种脱细胞板层角膜基质片的制备方法，其特征在于：在步骤三中，在手术显微镜下用宝石刀做角膜缘切口，伸入虹膜恢复器分离前层角膜，分离完全后用角膜剪剪下前层角膜，角膜缘切口深约1/3，厚为0.2-0.8mm，长为3mm，分离的板层厚度为0.2-0.8mm。

4.根据权利要求1所述的一种脱细胞板层角膜基质片的制备方法，其特征在于：在步骤五中，浸泡所用血清为人新鲜血清或人灭活血清，将板层角膜基质片放于装有人新鲜血清或人灭活血清的密闭无菌培养皿或EP管内浸泡，浸泡时间为12-30小时。

5.根据权利要求4所述的一种脱细胞板层角膜基质片的制备方法，其特征在于：将板层角膜基质片放于装有人新鲜血清或人灭活血清的密闭无菌培养皿或EP管内浸泡的时间为16-24小时。

6.根据权利要求1所述的一种脱细胞板层角膜基质片的制备方法，其特征在于：在步骤五中，进行漂洗采用的漂洗液为等渗液，漂洗液选自PBS，林格氏液或生理盐水，漂洗时间为0.5-5小时。

7.根据权利要求6所述的一种脱细胞板层角膜基质片的制备方法，其特征在于：在步骤五中，进行漂洗的时间为1-2小时。

8.根据权利要求1所述的一种脱细胞板层角膜基质片的制备方法，其特征在于：在步骤五中，冰浴电泳所用电泳液为TA电泳液，将整个电泳槽放于密闭消毒盒内进行冰浴电泳，3-5℃恒温冰箱内进行冰浴电泳，电泳的时间为1.5-2hs,电泳的电压为为120-150V；其中1×TA溶液配置方法:将4.84g TrisBase溶于100ml双蒸水中，滴加1.142ml冰醋酸，然后加双蒸水至1L。