[发明专利]一种丙烯酰胺单克隆抗体的制备方法

说明书

本发明公开了一种丙烯酰胺单克隆抗体的制备方法，属于抗体制备技术领域。所述方法包括丙烯酰胺抗原的制备和丙烯酰胺单克隆抗体的制备。所述抗原包括半抗原、免疫原和包被原，所述单克隆抗体制备包括动物免疫、细胞融合与克隆、单克隆抗体的腹水制备和纯化的步骤。本发明制备方法简单，免疫效果好；能够高效、稳定分泌抗丙烯酰胺单克隆抗体，该抗体具有效价高、特异性强、成本低廉的特点。

技术领域

本发明涉及一种抗体的制备方法，特别涉及一种油炸食品中可疑致癌物丙烯酰胺的免疫检测特异性单克隆抗体的制备。

背景技术

丙烯酰胺俗称“丙毒”，是一种白色晶体，分子式CH₂CHCONH₂，无气味，熔点为84.5℃，极易溶于水、乙醇、甲醇、丙酮、二甲醚和三氯甲烷中，微溶于苯、甲苯，丙烯酰胺分子中含有胺基和双链，化学性质相当活泼，可以发生霍夫曼反应、水解反应、迈克尔型加成反应和聚合反应等，是合成聚丙烯酰胺的原料。2002年4月，瑞典国家食品管理局召开新闻发布会，并在其官方网站上公布了在某些油炸或焙烤的淀粉类食品中检测出较高含量丙烯酰胺，而且含量超过饮水中允许最大限量的500倍。大量动物试验表明，丙烯酰胺可致动物多脏器肿瘤，包括乳腺、甲状腺、睾丸、肾上腺、中枢神经、口腔、子宫、脑下垂体等。国际癌症研究中心对丙烯酰胺的致癌性进行了评价，将其列为二类致癌物，即人类可疑致癌物。

由于丙烯酰胺具有潜在的神经毒性、遗传毒性和致癌性，引起全球研究人员的极大关注。且我国将食品中丙烯酰胺的检验列为“十五”国家重大科技专项“食品安全关键技术”课题，卫生部食品安全计划也将食品中丙烯酰胺检测方法的建立和我国食品丙烯酰胺分布调查作为一个重要部分。

目前丙烯酰胺的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱分析法(GC-MS)、液相色谱-质谱分析法(LC-MS)、液相色谱-串联质谱分析法(LC-MS-MS)等。这些方法灵敏度虽然高，却存在着样品前处理繁琐、检测耗时长、操作复杂，且成本高等缺点，难以满足快速鉴定诊断的需要。

近年来，具有特异性强、简单快速、灵敏度高等优点的酶联免疫吸附测定法(ELISA)受到广泛重视，在食品安全快速检测中显示了其独特的优势。而油炸食品中丙烯酰胺其免疫检测方面的研究报道较少，专利没有，因此，有必要开发丙烯酰胺快速筛查免疫检测技术。由于丙烯酰胺是小分子物质，其本身不具备免疫原性，免疫学上属于半抗原，不能刺激动物机体产生抗体，只有与大分子物质偶联成完全抗原才能促使动物机体产生免疫反应，从而获得抗体，因此，合成并纯化免疫性能良好的完全抗原，是研究和开发其免疫检测技术首要的关键步骤和技术难点。目前丙烯酰胺免疫检测技术只停留在多克隆抗体的研制及检测方法的建立方面，特异性较差。

发明内容

本发明是针对现有丙烯酰胺检测技术的不足，提供了一种丙烯酰胺抗原的合成及单克隆抗体的制备方法，使其具有抗体效价高、特异性强、成本低廉的特点。

本发明的丙烯酰胺单克隆抗体是通过以下技术方案得以实现的：

1、丙烯酰胺抗原的制备

(1)半抗原的合成

半抗原具体的合成方法如下：

利用迈克尔加成反应，丙烯酰胺与间巯基苯甲酸在硼砂的催化下在水中反应得到加成产物，质谱(mass)鉴定结果正确。半抗原的结构为：

简称AM。

(2)免疫原的合成

免疫原具体的合成方法如下：

半抗原的羧基通过NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)活化后与KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)的氨基缩合形成酰胺键，从而形成稳定的人工抗原——免疫原。