[发明专利]抗GITR/CTLA-4双特异性抗体及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种能同时结合两种抗原的双特异性抗体及其制备方法和用途， 具体的，本发明涉及一种能同时结合GITR和CTLA-4的双特异性抗体及其制备方 法和用途。

技术背景

T细胞是淋巴细胞的主要组分，在人体的免疫应答中发挥着重要的作用。其 产生的免疫应答效应主要包括两个方面：一方面，细胞毒性T细胞(cytotoxicT cell)通过其表面TCR受体与含有特定抗原的靶细胞特异性结合，破坏靶细胞膜， 直接杀伤靶细胞；另一方面效应性T细胞(effectorTcell)能够释放各种细胞因 子，例如IFNγ，IL4，IL13等，从而增强和扩大免疫效应。但是在肿瘤组织中， 由于受到肿瘤微环境的影响，T细胞活性受到显著抑制，并不能发挥其免疫应答 的作用。有证据表明，肿瘤组织中侵润的CD8⁺T细胞常表现出细胞因子分泌不 足，分化不全以及缺乏穿孔素和颗粒酶的表达等。此外，在多种类型的肿瘤中， 肿瘤细胞表达一些抑制性配体，通过与T细胞表面的抑制性受体相结合，通过 抑制性配体受体反应来负性调控T细胞的功能。因此，通过重建体内的免疫反 应过程，促使特异性识别肿瘤细胞抗原的T细胞增殖与分化，从而杀灭肿瘤细 胞，是肿瘤免疫治疗的一个热点领域。

T细胞的活化是一个十分复杂的过程，除了需要T细胞表面受体(Tcell receptor，TCR)与抗原递呈细胞(antigenpresentingcell，APC)上的MHC- 抗原肽复合物结合作为第一信号以外，T细胞的活化还需要T细胞表面的CD28 和APC细胞表面的B7结合提供第二信号。细胞毒T淋巴细胞相关抗原4 (CytotoxicTlymphocyteassociatedantigen4，CTLA-4)与CD28分子都是 共刺激分子B7的受体，与CD28起到活化T细胞的作用不同，CTLA-4与B7结合 以后能够抑制T细胞的激活，对T细胞的活化起负性调控作用。CTLA-4参与下 调T细胞反应以及诱导肿瘤组织中的T细胞耐受，使其成为肿瘤免疫治疗领域具 有吸引力的靶点。目前，百时美施贵宝公司开发的针对CTLA-4的特异性单克隆 抗体ipilimumab被美国FDA批准用于转移性黑色素瘤患者的治疗。对临床试验 中的肿瘤标本进行研究表明，黑色素瘤患者在接受ipilimumab治疗后，肿瘤组 织内的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的侵润显著增加，同时T细胞的活性显著增强， 因此，ipilimumab主要是通过增强T细胞的活性发挥其抗肿瘤作用。同时也有 研究表明，患者经过ipilimumab治疗后，肿瘤组织中CD4⁺T细胞增加的同时， CD4⁺CD25⁺调节性T细胞(Treg)的数目也显著增加，特别是在患者给予低剂量的 ipilimumab后，肿瘤组织中CD4⁺CD25⁺调节性T细胞增加的程度要明显高于CD4⁺T 细胞。(CTLA4blockadeexpandsFoxP3+regulatoryandactivatedeffector CD4⁺Tcellsinadose-dependentfashion)。CD4⁺CD25⁺调节性T细胞是一类免 疫调节细胞，表达IL-10等免疫抑制因子，能通过细胞-细胞接触依赖方式发挥 免疫抑制作用。目前有证据表明Treg细胞广泛存在于多种肿瘤组织中，并且起 到免疫抑制作用。消除肿瘤微环境中Treg细胞，能够抑制肿瘤的发展。因此， ipilimumab治疗所产生的Treg细胞对于其抗肿瘤疗效具有一定的抑制作用。临 床试验中，ipilimumab仅对部分具有较强免疫原性的肿瘤患者，如黑色素瘤等， 具有一定的临床疗效，但在其他免疫原性较低的肿瘤病人中并没有取得令人满意 的结果。因此，在通过CTLA-4抗体ipilimumab激活CD4⁺T和CD8⁺T细胞活性的 同时，消除Treg细胞在肿瘤微环境中的免疫抑制作用，进一步增强CD4⁺T和CD8⁺T 细胞的活性，会取得更加令人满意的抗肿瘤效果。糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因 子受体(glucocorticoid—inducedtumornecrosisfactorreceptor，GITR) 为肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)的第18个成员(TNFRSF18)，与其他一些 TNFRSF成员(4-1BB、CD27、OX40)的胞质结构域高度同源。GITR组成性高表达 在CD4⁺CD25⁺调节性T细胞(Treg细胞)中，在与其配体(GITRL)结合后发挥相 应的生物学作用。研究表明GITR信号通路的活化能够显著地抑制CD4⁺CD25⁺调节 性T细胞的免疫抑制作用。DTA-1作为GITR激活型抗体，发挥生理性GITRL的 作用，在小鼠黑色瘤细胞模型中，经DTA-1治疗后，Treg细胞的活性受到显著 抑制。因此，可以通过GITR的激动型抗体来活化Treg细胞中的GITR信号通路， 达到抑制Treg细胞活性的目的。还有研究表明GITR也在效应型T细胞和NK细 胞中表达，GITR信号通路的激活能够诱导效应T细胞的活化，调控T细胞的增 殖和分化。