[发明专利]一种补料生产L-茶氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种补料生产L-茶氨酸的方法，属于生物技术领域。

背景技术

L-茶氨酸(L-The)，又称N-乙基-γ-谷氨酰胺(5-N-ethyl-γ-glutamine)或γ-谷氨酰-L-乙胺(γ-glutamyl-L-ethylamine)，由日本科学家于1949年首次从绿茶中分离得到，是茶叶中特有的游离氨基酸，也是茶叶的主要风味物质。K.Susaoka等首次将该酶从茶的籽根中成功分离，并证明其对L-The、乙胺及ATP具有较高的亲和性，但该酶稳定性差，在体外极易失活。

近年来，据越来越多的研究报道，L-茶氨酸具有镇静减压、提高认知、增强免疫力以及预防肿瘤等重要生理功能，同时作为食品添加剂广泛应用于饮料、糖果、饼干、冰激凌等产品中，起到改善食品风味和提高营养价值等作用。

L-The在医药领域已用于预防癌症、预防阿尔茨海默症、控制抑郁症等方面；在保健食品中用于镇静放松、抗疲劳、提高学习记忆能力等方面；在普通食品中用于改善食品风味、强化营养等，也有报道用L-The进行饮用水进化、除臭、抗腐蚀剂及抗酸化剂的例子。L-The在市场的需求日渐广泛，需求量也越来越大，因此开发低成本、大规模制备L-茶氨酸技术的要求日渐迫切。

L-The的制备方法主要有从绿茶中直接提取法、化学合成法和微生物酶法。

直接提取L-The的方法有传统的化学试剂沉淀法和随后发展起来的离子交换层析法。化学试剂沉淀法的主要采用热水浸泡茶叶而形成茶汤或冷乙醇提取获得提取液，加入碱式碳酸铜使L-The与之反应析出形成L-The-铜盐沉淀，使用稀硫酸溶解后通入H₂S气体去除Cu²⁺后加入一定量Ba(OH)₂沉淀液体中SO₄^2-等杂质，得到较纯的L-The液体，最后对液体通过抽滤、浓缩、结晶、精制等步骤，获得高纯L-The粉末或晶体。离子交换法采用合适的溶液pH使目标氨基酸带上相应的电荷，并通过离子交换柱达到分离提取的目的。直接提取法生产L-The具有原料成本高、提取工序复杂、得率低等缺点，不能满足低成本、大规模制备高纯L-The的市场要求。

化学合成法主要分为三条合成路线：1.吡咯烷酮酸或焦谷氨酸法，利用乙胺和L-吡咯烷酮酸生成L-茶氨酸。N.Lichtenstein等于1942年在实验室中用乙胺和L-吡咯烷酮酸在水溶液中反应，合成L-The，但收率较低；后人尝试用L-吡咯烷酮酸和无水乙胺在低温下反应或营造惰性环境等，提高了L-The的收率；2.N-取代谷氨酸酯和乙胺水解反应产生N-取代茶氨酸；3.N-取代谷氨酸酐法，首先利用保护基保护L-谷氨酸中的α-氨基，然后进行分子内脱水形成环状谷氨酸酐，再与乙胺作用生产N-取代茶氨酸，最后去除保护基团得到L-The。化学合成法存在反应时间长、收率低等缺点，同时由于需要采用高压、惰性气体保护和保护基团等方式，增加生产成本。

微生物酶法合成L-The具有操作简单，构型专一，放大生产容易等优点，是降低生产成本，提高生产强度的有效途径，现已逐渐代替直接提取法和化学合成法，成为L-The大规模生产的主流方法。然而，现有的研究存在γ-谷氨酰转肽酶(γ-GGT)的酶种开发较少，野生酶酶活较低，对L-The生产应用的效果有待提高，在高底物浓度下反应的研究较少等缺点，这些不足限制了其工业化应用进程。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供了一种生物法生产L-The的工艺，降低了L-The的生产成本。

为解决上述问题，本发明技术方案为：

采用来源于Bacillus subtilis的γ-GGT重组酶生产L-The：L-谷氨酰胺(L-Gln)和乙胺盐酸盐按照一定比例配制成底物溶液，调pH 9-11后，按照每毫升反应液2-20个单位的量加入来源于枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)，中国典型微生物保藏中心，CCTCC AB 130001)GGTase，充分反应10-20小时，采用恒速和变速补料工艺提高L-The产量。

所述恒速补料方法为：L-Gln和乙胺盐酸盐按照一定比例配制成底物溶液，调pH 9-11后，按照每毫升反应液2-20个单位的量加入GGTase，每2h补加一定量的底物，反应10-20小时生产L-The。