[发明专利]一种烟碱降解菌筛选培养基及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物培养技术领域，尤其涉及一种烟碱降解菌筛选培养基及其制备方法。

背景技术

烟碱(Nicotine)，俗名尼古丁，是一种存在于茄科植物(茄属)中的生物碱，也是烟草的重要成分，占烟草生物碱的95％以上。人体长期过量摄入烟碱，会麻痹心脏、抑制中枢神经，大幅度提高患呼吸系统、心脑血管等方面疾病的几率。烤烟燃烧过程中由烟碱亚硝化产生的N-亚硝铵是一种强烈的致癌剂，对主动吸烟和被动吸烟者均具有极大的健康危害。因此，如何控制和降低烟叶中的烟碱含量，是烟草种植和卷烟生产企业共同面临的棘手问题，开展相关研究具有很强的现实意义。

通过微生物发酵的方法降低烤烟中的烟碱含量，逐渐得到国内烟草行业的重视，国外烟草行业很早就开始了运用微生物降解烟碱的研究与实践，并取得了一定的成效。目前，各类文献报道的烟碱降解菌筛选培养基配方基本相同，不同之处表现在相同组分的用量调整上。现有的培养基配方及其制备方法如下：酵母粉1g，K₂HPO₄ 13g，KH₂PO₄ 4g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，10ml微量元素(MgSO₄·7H₂O 1g，MnSO₄·H₂O 0.4g，CaCl₂·2H₂O 0.2g，CuCl₂·2H₂O 0.2g，FeSO₄·7H₂O 0.02g，用0.1mol/L HCl定容至100ml)，琼脂粉20.00g，加蒸馏水至1000ml，自然pH。培养基121℃高压蒸汽灭菌20min，当温度降至60℃时，加入适量用0.22μm滤膜过滤的烟碱。

采用以上培养基配方虽然可以筛选烟碱降解菌，但存在的问题也较为突出，这些不足集中体现在：(1)不适合特殊类型土壤样品烟碱降解菌的筛选；(2)微量元素不平衡，客观性不强；(3)筛选出的烟碱降解菌多样性较差，难以筛出稀有菌资源。

发明内容

本发明的实施例提供一种烟碱降解菌筛选培养基及其制备方法，可以兼顾配方的广谱性和针对性；提高筛选烟碱降解菌资源的多样性，减少和降低不必要的重复筛选；提高烟碱降解菌稀有种类的出菌率，丰富实际生产和研究领域中对高效烟碱降解菌的需求资源。

为达到上述目的，本发明的实施例采用如下技术方案：

一种烟碱降解菌筛选培养基，包括：牛肉膏2g，酵母粉1g，吉兰糖胶3g，海藻糖0.5g，K₂HPO₄ 13g，KH₂PO₄ 4g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，NaCl 5g，CaCl₂ 0.5g，样品环境土壤浸出液600ml，烟碱1g，琼脂粉18g，蒸馏水定容至1000ml，自然pH。

一种烟碱降解菌筛选培养基的制备方法，包括：

A.样品环境土壤浸出液的制备：取采样环境的土壤500g，置于大三角瓶中，加入无菌水900ml，180r/min，室温震荡30min，静置沉淀，取上清；再将上清于121℃高压蒸汽灭菌20min，即得所述样品环境土壤浸出液，4℃保存备用；

B.称取海藻糖0.5g，置于三角瓶，加100ml蒸馏水，于0.06MPa，112.6℃条件下高压蒸汽灭菌15min，即得海藻糖溶液，放入60℃条件恒温箱中保存备用；

C.称取吉兰糖胶3g，用制得的土壤浸出液600ml缓慢溶解，再依次加入K₂HPO₄ 13g，KH₂PO₄ 4g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，NaCl 5g，CaCl₂ 0.5g，牛肉膏2g，酵母粉1g和琼脂粉18g，用蒸馏水定容至900ml，搅拌均匀后转入三角瓶，121℃条件下高压蒸汽灭菌20min；当冷却至60℃左右时，以无菌操作手续加入灭菌的海藻糖溶液100ml；

D.用0.22μm滤膜规格的针头过滤器加入烟碱1g，同方向轻柔转动混匀，即得烟碱降解菌筛选培养基。