[发明专利]一种L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选方法

权利要求书

1.一种从海洋环境中高通量筛选耐碱的L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的方法，包括如下步骤：

1)采用含有质量百分含量1％-2％的NaCl富集培养基对来自海绵、珊瑚、海底淤泥的样品中的微生物进行富集培养与初步分离；

2)将步骤1)分离得到的单菌落穿刺接种含有质量百分含量0.05％CaCl₂的初筛半固体培养基，培养后根据培养基的浑浊程度筛选L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌；

3)将步骤2)初筛得到的菌株接种复筛培养基，20℃-37℃恒温培养后离心收集菌体，与生物转化液混合，于20℃-37℃孵育12-24小时；采用纸层析法分析生成的L-丙氨酸含量，得到L-天冬氨酸β-脱羧酶高产菌株；

4)将步骤3)复筛得到的高产菌株接种摇瓶发酵培养基，20℃-37℃恒温培养后离心收集菌体，与生物转化液混合，混合物20℃-37℃孵育12-24小时，然后氧化显色法测定L-天冬氨酸β-脱羧酶酶活性；

上述富集培养基、初筛半固体培养基、复筛培养基、摇瓶发酵培养基和生物转化液的pH值为8.5-9.0。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述富集培养的方式为：将微生物样品用富集培养基洗涤三次，然后接种到富集培养基，温度20℃-37℃、转速100-200转/分钟振荡培养2-4天；所述富集培养基各组分的质量百分含量为：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，酵母粉0.2％，KH₂PO₄ 0.05％,K₂HPO₄·H₂O 0.14％，NaCl 1.5％，pH8.5-9.0。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述初筛半固体培养基各组分的质量百分含量为：L-天冬氨酸2％，葡萄糖3％，蛋白胨1％，酵母粉0.2％，NaCl 1.5％，KH₂PO₄0.05％,K₂HPO₄·H₂O 0.14％，MgSO₄·7H₂O 0.03％，CaCl₂ 0.05％，琼脂0.8％，pH 8.5-9.0；将所述初筛半固体培养基分装于96孔酶标板，制得初筛半固体培养基孔板。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)中，所述复筛培养基各组分的质量百分含量为：葡萄糖3％，蛋白胨1％，酵母粉0.2％，NaCl 1.5％，KH₂PO₄ 0.05％,K₂HPO₄·H₂O0.14％，MgSO₄·7H₂O 0.03％，CaCl₂ 0.05％，pH 8.5-9.0。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4)中，所述摇瓶发酵培养基各组分的质量百分含量为：葡萄糖3％，蛋白胨1％，酵母粉0.2％，NaCl 1.5％，KH₂PO₄ 0.05％,K₂HPO₄·H₂O 0.14％，MgSO₄·7H₂O 0.03％，CaCl₂ 0.05％，pH 8.5-9.0。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)与步骤4)中，所述生物转化液各组分的质量百分含量为：L-天冬氨酸2％，KH₂PO₄ 0.05％,K₂HPO₄·H₂O 0.14％，pH 8.5-9.0。