[发明专利]一种台湾肖楠幼嫩叶片快速繁殖无菌苗

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及植物的无性组织培养，尤其涉及台湾肖楠幼嫩叶片快速繁殖无菌苗。

背景技术

台湾肖楠（Calocedrus formosana (Florin) Florin）又称肖楠、黄肉仔、黄肉树，柏科肖楠属常绿大乔木，为台湾特有裸子植物，分部于台湾北部及中部海拔300～1900米的山地，为台湾暖带林（500~1800m）的主要造林树种。是台湾针叶树五木之一。台湾肖楠树形为直干长圆锥状，树皮红褐色，刀切后会流出淡红色树脂。材质绵密，不易受白蚁蛀蚀，色泽偏黄褐色，为高级木材。与台湾扁柏、红桧、香杉、台湾杉等同列台湾针叶五木。雌雄同珠，球果木质化，为长椭圆形，种子有两翅。叶为鳞片状，细小但比扁柏细长。由于过去的大力采伐天然林，致使台湾肖楠天然族群量极稀少，且族群有高龄化倾向。

经查阅相关文献表明台湾肖楠母树稀少，结实不佳，扦插繁殖成活率不高，且生长缓慢。（钟镇德，2000）以不同的育林作业方式，对台湾肖楠开花结实的影响研究表明，以断根、修枝及断根且修枝等方式处理24年生的台湾肖楠母树，但连续两年只促进0~2.4%的植株开花，效果不佳。（忠兴郭，2002）以GA₃对台湾肖楠开花旺盛期进行处理，93.9%可以开花，但雄花大量提前掉落，造成结实率不高。（郭宝章，1989）进行台湾肖楠扦插繁殖试验，但成活率不到2%,且成活的扦插苗生长缓慢。

经查阅相关文献，目前在大陆还未见有关台湾肖楠组织培养、扦插等方面的报道。而台湾学者在台湾肖楠组织培养研究方面也未有较大突破，林志谋等（1997）指出未成熟胚添加600mg/Lcasein enzymatic hydrolysate、500mg/L yeast extract、0.5mg/L BA及1mg/L NAA的WPM培养基中可诱导出芽，但出芽率较低。用4～6个月的实生苗茎段及叶片，在WPM+0.05 mg/LNAA+1mg/LBA可诱导腋芽发生，但芽体有玻璃化现象，以相同的外植体接种在WPM +0.01mg/LBA+0.05mg/LTDZ培养基中，不定芽诱导率也仅仅能达到60%。愈伤组织在MS+ 1mg/LNAA+0.1mg/LBA培养基中的诱导效果较好，但愈伤组织再分化为丛生芽的效果不好。

经查阅相关文献进行综合分析认为：目前虽已有台湾方面相关科研人员对台湾肖楠进行了组织培养方面的研究，但总体效果不好，未见完整的组培快繁体系报道，而本发明探索出了利用台湾肖楠幼嫩叶片快速繁殖无菌苗的最佳培养基配方及培养方法，本发明具有一定的独创性和新颖性。

发明内容

本发明的目的是建立一套用台湾肖楠幼嫩叶片快速繁殖无菌苗，从而构建了不依靠单纯的种子繁殖或扦插繁殖进行栽培的传统种植模式，利用组培技术繁殖出的种苗最大限度的保持了母本的特性，同时可在短期内获得大量性状一致、脱毒的台湾肖楠无菌苗，为野生台湾肖楠资源的保护、群落的恢复和利用台湾肖楠在大陆地区作为退耕还林、植树造林等的树种及合理利用提供了一种新的技术支撑。

本发明可通过以下技术实现

外植体培育

1） 将从台湾引进的一棵台湾肖楠种植在基质为腐殖土的盆中，视土壤含水量浇水，置于向阳通风处备用，待需要外植体材料时，用不锈钢剪刀剪取位于顶端新长出的叶片，作为外植体材料来源，外植体采集宜于在晴天的8:00~10:00进行。

2）无菌苗获取

 剪取的外植体材料，置于洗净的烧杯中，滴入1-3滴普通洗洁精，1滴吐温20，盖上纱布并绑扎好，置于自来水下流水冲洗5h；冲洗后的外植体材料于超净工作台上，先用75%酒精浸泡50s，用无菌水冲洗3次，而后将冲洗后的外植体用灭菌后的镊子放入0.1%的升汞中消毒8min，无菌水冲洗6次，每次1.5min，然后将外植体放入事先准备好的无菌培养皿内，用无菌滤纸吸干材料上残留的水分，接种前将叶片用无菌不锈钢刀片切成1.5cm的小段，然后将切好的外植体接种到过渡培养基中，（MS(无肌醇)+0.01~3.0mg/LNAA+5~7g/L琼脂）。

待在过渡培养基中培养15~20d时，挑取无污染的外植体进行愈伤组织诱导。

 3）愈伤组织诱导