[发明专利]一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法

说明书

 

技术领域

本发明属于食品检测领域，具体涉及一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法。

背景技术

凡能发酵碳水化合物产物乳酸的细菌统称为乳酸菌，乳酸菌是一种革兰氏阳性菌，根据其种系进化过程中形成的不同生化指标可将其分为：低GC含量组，如乳酸杆菌属、肠球菌属及乳酸球菌属等，高GC含量的双歧杆菌，这些菌种形态结构、代谢特征及生理学特点等均不这完全相同。人类及其他动物体内如肠道、阴道黏膜等部位均天然存在着乳酸菌。乳酸菌可帮助调节肠道微生物平衡，促进营养吸收，可改善肝功能，防止乳糖不耐症，还有抗癌及抗衰老等作用。将乳酸菌用于食品中，可提高食品附加值及保藏性。正因为乳酸菌的上述优点，目前，乳酸菌已作为益生菌在乳制品中广泛添加，同时，也广泛用于药品领域中。此外，乳酸菌在工业领域中也有广泛应用，如用其发酵产生苹果酸及乳酸来酿造苹果酒及葡萄酒。

虽然乳酸菌在生活各大领域中均有广泛应用，但随着食物种类的增多，乳酸菌应用也带来了一系列的安全问题，其质量问题也日益严重化与多样化。目前，市场上发酵乳制品种类繁多，且均宣称含有多种乳酸菌，给消费者的选择及相关部门的质量监督均带来较大困难。因此，对食品尤其是发酵乳制品中的乳酸菌种类进行定性检测以更好的对发酵乳制品进行质量管理，保障消费者的权利具有重要意义。

乳酸菌的传统定性检测方法采用生理生化反应及选择性培养基进行分离培养计数，但这些方法易受培养条件及菌种特性等多种主客观因素的影响，检测过程费时长，检测结果稳定性及可靠性均较差，因此，将其用于市售发酵乳制品的大样本随机抽查具有较大的局限性。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中存在的缺陷提供一种一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法。

本发明的技术方案如下：

一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法，包括以下步骤：

（1）细菌培养：取5-10ml样品加入10-20ml灭菌水中稀释震荡混匀，平板涂片于MRS培养基中，恒温培养12-24h，取样品菌落；

（2）取步骤（1）中取的菌落进行革兰氏染色，并在显微镜下观察细菌形态；

（3）将步骤（1）中的菌落加入10-20ml PBS缓冲液中，制成菌悬液，将菌悬液取1.5ml加入离心管中，加入等体积的氯仿，混匀2-5min，离心，取上清液,加无菌水或TE缓冲液500-700ul混匀重悬，离心，取上清液作为待测样品溶液；

（4）DNA提取：取步骤（3）中制得的待测样品溶液至另一离心管中，采用酚氯仿抽提2次，加入0.1倍体积的醋酸钠及1倍体积的异丙醇沉淀DNA，再采用体积浓度为70%-80%的乙醇溶液洗涤沉淀2次，自然干燥，加双蒸水溶解，得样品DNA模板；

（5）PCR扩增：将步骤（4）中提取的DNA模板进行DNA扩增，PCR反应体系各组分为：

模板DNA                        2.0ul; 

引物对                           2.5ul; 

10×Taq Buffer(Mg²⁺ plus)           2.5ul;

Dntp Mixture                      2.0ul;

TaKaRa Taq(5U/UL)                0.125ul

无菌离子水加至25ul; 

PCR扩增程序为：

94℃变性 5min，94℃ 30s，52℃ 45s，72℃ 1.5min，循环30次，最后72℃退火10min；

（6）对步骤（5）中PCR扩增产物进行琼脂凝胶电泳检测，观察检测结果。

步骤（1）中MRS培养基的组分为：葡萄糖20g，牛肉膏20g,琼脂15g，蛋白胨10g，酵母提取物5g、乙酸钠5g、柠檬酸二铵2g，磷酸氢二钾2g，硫酸锰水合物0.8-1g，加蒸馏水至1L,加PH调节剂至PH为6.2-6.5,高压灭菌备用。

优选的，所述的硫酸锰水合物为硫酸锰的硫酸锰四水合物与硫酸锰七水合物的混合物。

优选的，所述的硫酸锰四水合物与硫酸锰七水合物的质量比为（0.8-1.2）：（0.6-1.0）。

优选的，所述的PH调节剂选自硫酸、盐酸、氢氧化钠或氢氧化钾中的一种或多种。

优选的，步骤（1）中所述的恒温培养温度为35-40℃。