[发明专利]一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法

权利要求书

1.一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）细菌培养：取5-10ml样品加入10-20ml灭菌水中稀释震荡混匀，平板涂片于MRS培养基中，恒温培养12-24h，取样品菌落；

（2）取步骤（1）中取的菌落进行革兰氏染色，并在显微镜下观察细菌形态；

（3）将步骤（1）中的菌落加入10-20ml PBS缓冲液中，制成菌悬液，将菌悬液取1.5ml加入离心管中，加入等体积的氯仿，混匀2-5min，离心，取上清液,加无菌水或TE缓冲液500-700ul混匀重悬，离心，取上清液作为待测样品溶液；

（4）DNA提取：取步骤（3）中制得的待测样品溶液至另一离心管中，采用酚氯仿抽提2次，加入0.1倍体积的醋酸钠及1倍体积的异丙醇沉淀DNA，再采用体积浓度为70%-80%的乙醇溶液洗涤沉淀2次，自然干燥，加双蒸水溶解，得样品DNA模板；

（5）PCR扩增：将步骤（4）中提取的DNA模板进行DNA扩增；

（6）对步骤（5）中PCR扩增产物进行琼脂凝胶电泳检测，观察检测结果。

2.根据权利要求1所述的所述的一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法，其特征在于，步骤（1）中MRS培养基的组分为：葡萄糖20g，牛肉膏20g,琼脂15g，蛋白胨10g，酵母提取物5g、乙酸钠5g、柠檬酸二铵2g，磷酸氢二钾2g，硫酸锰水合物0.8-1g，加蒸馏水至1L,加PH调节剂至PH为6.2-6.5,高压灭菌备用。

3.根据权利要求2所述的所述的一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法，其特征在于，所述的硫酸锰水合物为硫酸锰的硫酸锰四水合物与硫酸锰七水合物的混合物。

4.根据权利要求3所述的所述的一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法，其特征在于，所述的硫酸锰四水合物与硫酸锰七水合物的质量比为（0.8-1.2）：（0.6-1.0）。

5.根据权利要求1所述的所述的一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法，其特征在于，所述的PH调节剂选自硫酸、盐酸、氢氧化钠或氢氧化钾中的一种或多种。

6.据权利要求1所述的所述的一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法，其特征在于，步骤（1）中所述的恒温培养温度为35-40℃。

7.根据权利要求1所述的所述的一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法，其特征在于，步骤（3）中所述的离心速度为8000-10000r/min，离心时间为5-10min。

8.根据权利要求1所述的所述的一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法，其特征在于，步骤（4）中所述的DNA提取液PH为7.8-8.2，其组成为：80-100mol/L的Tris-HCl,80-100mol/L的EDTA，80-100mmol/L的磷酸钠，1.0-1.5mol/L的氯化钠，0.5-1%的CTAB。

9.根据权利要求1所述的所述的一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法，其特征在于，步骤（5）中PCR扩增采用的的引物对为：上下游引物：

F(WLABl)：5'-TCCGGKTTTATTGGGCGTAAAGCGA-3’；

R(WLAB2)：5'-TCGAATTAAACCACATGCTCCA-3’。

10.根据权利要求1所述的所述的一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法，其特征在于，步骤（6）中的结果观察具体为：电泳检测出现唯一一条PCR扩增条带，判断为阳性，若出现了该条带的同时也出现了其他条带，判断为阴性，此时对PCR扩增产物进行illumina genome analyzer测序。