[发明专利]一种分析蛋白O-糖基化位点的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种分析蛋白O-糖基化位点的方法，特别涉及一种采用内切酶和外切酶部分降解糖链并联合液质联用技术对糖蛋白O-糖基化位点进行检测和鉴定的方法，属于生物技术技术领域。

背景技术

蛋白的糖基化是一种重要的翻译后修饰。主要有N-糖基化(N-glycosylation)和O-糖基化(O-glycosylation)两种形式。蛋白糖基化参与了细胞的很多过程，并扮有重要的角色。此外，癌症等一些疾病的发生发展过程常伴随着蛋白的糖基化位点及糖链的异常变化。因此，糖基化位点的分析对于研究揭示糖蛋白的异常变化至关重要。位点分析不仅可以直观的得到特殊疾病的标志物糖基化的改变信息，也能使进一步的糖链结构位点特异性分析变得更加直接方便。

因为N-糖基化发生在蛋白质特征序列上，有共同的五糖核心结构，并且具有从蛋白质上释放N-糖链的通用糖苷内切酶，因此，蛋白N-糖基化位点的分析方法已经很成熟。相比之下，O-糖基化位点的分析具有极大的挑战。O-糖基化发生在丝氨酸或者苏氨酸上，没有特征修饰序列可做修饰位点预测；O-糖链的结构较复杂，至少存在8种核心结构；并且，还没有发现能将O糖链从蛋白上释放的通用内切酶，这些原因使得O-糖基化位点的分析困难重重。

通常O-糖基化位点的分析会用到化学释放法如β-消除法(Zheng Y,et al.Talanta2009，78:358-363)，但是化学法有时难以控制会产生一些副反应。除以上方法外，还有其它的一些外切酶方法(P et al.J Proteome Res，2007，6:3021-3031)，鉴定得到的O-糖基化位点比较有限。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种混合外切酶法分析蛋白O-糖基化位点，可用于糖蛋白等疾病生物标志物糖基化位点的分析。

发明概述

本发明利用内切酶与混合外切酶切去N糖链与O-糖链，连接N-糖链的天冬酰胺变为天冬氨酸，连接O-糖链的丝氨酸或苏氨酸只留有一个GalNAc糖标签。单个蛋白的肽段采用LC/MS/MS直接分析，发生O-糖基化的肽段分子量增加203Da，通过高分辨质谱获得精确分子量以及二级碎片信息，据此找出O-糖基化位点。组学样本的O-糖基化分析，先用榴莲凝集素将切剩一个GalNAc单位的糖肽富集，从而对位点进行分析。该方法简单，快速，高通量，可以用于标准样品和实际样品的糖基化位点的检测。

发明详述

一种分析蛋白O-糖基化位点的方法，步骤如下：

(1)将蛋白质组样品或单个蛋白样品经内切酶酶切后，再经内切糖苷酶和外切糖苷酶组合切除N糖链与部分O-糖链，经减压干燥，制得带有GalNAc糖标签的肽段和非糖肽的组学蛋白样品或单个蛋白样品；

(2)将步骤(1)制得的带有GalNAc糖标签的肽段和非糖肽的组学蛋白样品上样于榴莲凝集素色谱柱进行分离，收集到酶切后带有GalNAc糖标签的肽段溶液，经减压干燥后，制得组学蛋白样品；

(3)将步骤(1)制得的单个蛋白样品或步骤(2)制得的组学蛋白样品使用C₁₈反相色谱柱分离，然后在正离子模式下用高分辨质谱仪进行检测，得到高分辨质谱图；

(4)将得到的质谱数据用Mascot Distiller软件进行处理，再用MASCOT在SwissProt数据库中进行搜索，参数设定如下：

酶最大漏切位点：2；

固定修饰：Carbamidomethylation，半胱氨酸；

可变修饰：+HexNAc，203Da，丝氨酸和苏氨酸；+0.9840Da，天冬酰胺变成天冬氨酸；氧化，甲硫氨酸；乙酰化，N-末端；环化，N-末端；

母离子质量误差为15ppm，二级碎片质量误差为0.8Da；通过搜库结果获得蛋白糖基化位点信息。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中内切酶为：胰蛋白酶或蛋白内切酶Glu-C(金黄色葡萄球菌V8)，内切酶与蛋白样品的质量比为1：(20～30)。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中内切糖苷酶为：肽N-糖苷酶F(PNGase F)。