[发明专利]一种检测黑白轮枝菌的实时荧光PCR检测试剂

说明书

技术领域

 本发明涉及黑白轮枝菌的检测，具体涉及一种检测黑白轮枝菌的实时荧光PCR检测试剂。

背景技术

植物病原性轮枝菌主要包括：黑白轮枝菌Verticillium albo-atrum Reinke and Berthold (1879)、大丽轮枝菌V. dahliae Klebahn (1913)、三体轮枝菌V. tricorpus Isaac (1953)、变黑轮枝菌V. nigrescens Pethybridge (1919)、云状轮枝菌V. nubilum Pethybridge (1919)、V. theobromae (Turconi) Mason and Hughes (1951)等。它们多能引起植物维管束病害，造成植物叶片黄化、落叶等症状，严重时导致植物死亡。这些轮枝菌可产生多种休眠形态，如微菌核、厚垣孢子或休眠菌丝等，长时间在土壤中存活。由于其严重危害性，其中的一些种类，如大丽轮枝菌和黑白轮枝菌已经被列为我国重要植物检疫对象。由黑白轮枝菌所引起的苜蓿黄萎病可对苜蓿生产造成毁灭性危害， 随进口种苗进入我国并在我国的种植区定殖可能性极大。黑白轮枝菌检测有传统形态学方法和PCR方法（如公告号为CN1182398C的发明专利），但形态学很难准确快速区分，也存在鉴定周期长、时效性差等问题。而PCR方法需进行PCR后处理，易发生交叉污染，存在假阳性、假阴性或特异性不强等缺点，检测方法费时、繁琐、专业人员素养要求高，难以满足口岸快速检测通关需要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测黑白轮枝菌的实时荧光PCR检测试剂，该检测试剂可以快速、准确、特异检测黑白轮枝菌，避免交叉污染、假阳性、假阴性等问题。

一种检测黑白轮枝菌的实时荧光PCR检测试剂，包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，引物和探针的核苷酸序列如下：

正向引物（VA3F）：5'- GAG TCC CGA ACC ACG TTG TC -3'；

反向引物（VA3R）：5'- GAG GTG TGT AGT ATG GTC AGG TTT GA -3'；

探针（VAMGB3）：5'- AAG ACG ACG ACA CGC G -3'，探针5'端含有FAM报告荧光染料，3'端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。该检测试剂扩增的目标片段长度为103 bp，其核苷酸序列为：GAGTCCCGAA CCACGTTGTC CCGACCACGC CCGCGAGAGA CGACGACACG CGAAGACGAC GACACGCGAA GACGACGTCA AACCTGACCA TACTACACAC CTC。

本发明的优点在于一种检测黑白轮枝菌的实时荧光PCR检测试剂，以待检测样品DNA为模板，用检测黑白轮枝菌的引物和探针进行实时荧光PCR，检测扩增产物荧光信号，检测简单、快速、灵敏、准确、特异，与模板互补配对的荧光探针提高了特异性，有效地避免假阳性和假阴性，检测时荧光信号自动收集，避免普通PCR反应后电泳分析中人为因素干扰，检测过程完全闭管，不需PCR后处理，消除了PCR产物的污染。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1、检测黑白轮枝菌的专用引物和探针的设计

从GenBank调出黑白轮枝菌及其近似种β-微管蛋白的基因序列，利用DNAMAN 6.0.40软件进行比对分析，找出黑白轮枝菌的保守基因序列，根据引物和探针设计的一般原则，用软件Primer Express 3.0设计引物和TaqMan-MGB探针，再将设计的引物和探针在NCBI上比对，通过筛选最终确定一对引物和一条探针，其序列为： VA3F：5'- GAG TCC CGA ACC ACG TTG TC -3'； VA3R：5'- GAG GTG TGT AGT ATG GTC AGG TTT GA -3'； VAMGB3：5'- AAG ACG ACG ACA CGC G -3'，探针5'端含有FAM报告荧光染料，3'端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。

实施例2、实时荧光RT-PCR检测黑白轮枝菌的特异性试验

具体过程包括以下步骤：

一、样品来源