[发明专利]一种His标签包涵体蛋白纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白纯化技术领域，具体涉及一种His标签包涵体蛋白的纯化方法。

背景技术

包涵体是指大肠杆菌高效表达的重组蛋白在细胞内凝集，形成的不溶的、无活性的固体颗粒。一般含有50％(质量分数)以上的重组蛋白，及少量的核糖体、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白、脂多糖等，易于对目标蛋白进行分离纯化。另外大肠杆菌表达体系具有培养周期短、成本低、高效表达等优点，在生产中被广泛应用。但得到的包涵体蛋白必须经过变性溶解及复性处理，才能使目标蛋白恢复其生物活性。因此，优化包涵体蛋白变性复性过程，得到具有生物活性的蛋白，将是大量生产重组蛋白最有效的途径之一。

目前常用的包涵体变性剂有尿素、盐酸胍及一些常见的去垢剂如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等。6-8M尿素为报道使用最多的变性剂，通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展。但是尿素易分解产生异氰酸盐导致多肽链的自由氨基甲酰化，不能长期储存，尤其是在高浓度、温度及碱性PH条件下。变性溶解得到的包涵体蛋白通常采用最简单的稀释法和透析法并辅以适当的添加剂逐步降低尿素浓度对目标蛋白进行复性。但复性过程缓慢，耗时较长，易造成蛋白的降解或重新聚集，使得蛋白回收率较低。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种His标签包涵体蛋白的纯化方法，该方法以更加温和的变性条件处理包涵体，以保证变性过程不会造成蛋白生物活性损失，从而可以在变性溶解后直接纯化而省去复性步骤。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种His标签包涵体蛋白的纯化方法，包括以下步骤

1)取待纯化的包涵体，先用包涵体洗涤液对其进行洗涤，再用PBS对其进行洗涤；

2)取包涵体裂解液，对步骤1)洗涤完毕的包涵体进行溶解，室温震荡，充分溶解后离心收集上清；

3)利用Ni-NET柱对步骤2)得到的上清液进行纯化，过程中利用洗液洗脱杂蛋白，利用洗脱液洗脱目的蛋白，而后利用透析缓冲液对洗脱的目的蛋白进行透析。

上述包涵体裂解液是其中具有50～100mM CAPS，0.1-1％N-十二烷基肌氨酸钠的溶液，其pH为8.0～9.0。

优选的，同时满足：所述透析缓冲液是其中具有50～100mM NaH₂PO₄，400～500mM Tris的溶液，其pH为8.0～9.0；所述洗液是其中具有50～100mM NaH₂PO₄，10～50mM Tris-Cl，5-10mM咪唑的溶液，其pH为7.5～8.5；所述洗液是其中具有50～100mM NaH₂PO₄，10～50mM Tris-Cl，100-300mM咪唑的溶液，其pH为7.5～8.5。

优选的，步骤1)所述的包涵体洗涤液是其中具有20mM Tris-Cl，1％Triton X-100的溶液，其PH为8.0～9.0。

优选的，步骤1)利用包涵体洗涤液对包涵体洗涤的次数为2～3次。

优选的，步骤1)利用PBS对包涵体洗涤的次数为2～3次。

同时本发明还提供了一种His标签包涵体蛋白的裂解液，其中具有50～100mM CAPS，0.1-1％N-十二烷基肌氨酸钠，且其pH为8.0～9.0。

本发明以N-十二烷基肌氨酸钠为变性剂，以碱性PH的CAPS(N-环己基-3-氨基丙磺酸)为缓冲液，裂解包涵体蛋白。N-十二烷基肌氨酸钠为一种表面活性剂，通过破坏蛋白内的疏水键溶解包涵体蛋白，变性条件较为温和。该变性方法的最大特点是，避免了尿素易分解产生异氰酸盐导致蛋白多肽链的自由氨基甲酰化的缺陷，溶解蛋白经Ni-NTA柱纯化效果优于尿素，蛋白溶解后即具有生物活性，无需做复性处理。

附图说明

图1是本发明实施例1两种变性液裂解处理的包涵体经Ni柱纯化后SDS-PAGE分析结果；图中区域1对应未诱导菌体，区域2对应诱导菌体，区域3对应包涵体裂解上清，区域4对应包涵体裂解后沉淀，区域5对应裂解上清过柱残液，区域6对应洗液，区域7对应洗脱蛋白(以Buffer 2为裂解液)，区域8对应洗脱蛋白(以尿素为裂解液)。

具体实施方式

实施例1 以尿素为变性剂处理包涵体与本发明方法处理包涵体对后续蛋白纯化效果的比较

1.1本发明方法所用到的试剂