[发明专利]一种快速测定葡萄糖氧化酶活力的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种快速测定葡萄糖氧化酶活力的方法。 

背景技术

葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase，E.C.1.1.3.4，简称GOD)是一种需氧脱氢酶，其系统命名为β-D-葡萄糖氧化还原酶。该酶最早于1928年由Mǖller从黑曲霉中分离并报道，Pazur于1965年获得了纯的葡萄糖氧化酶。在有氧气存在的情况下，葡萄糖氧化酶能专一性地氧化β-D-葡萄糖，生成葡萄糖酸和过氧化氢，在葡萄糖酸盐生产工业、食品添加剂、动物饲料添加剂、生化检测和生物传感器等方面具有广泛的应用。 

目前，葡萄糖氧化酶活力主要的检测方法有滴定法、电化学法和分光光度法。滴定法的原理是葡萄糖氧化酶酶催化葡萄糖生成葡萄糖醛酸，再通过酸碱滴定可以间接测定出葡萄糖醛酸的产量，然后根据葡萄糖醛酸的产生量计算出GOD的酶活力。此方法虽然简单易行，成本低，但是该方法存在检测误差大和灵敏度低的缺点，而且需要进行繁复的移液滴定操作，工作量较大。电化学法的原理是根据酶促反应中的电压或电流的变化来测量氧化还原性酶活力，以氧电极进行测定，然而这个方法容易受到检测液中溶氧和其他电化学活性物质的干扰，从而影响实验结果。分光光度法的原理是在有氧的情况下，葡萄糖氧化酶催化β-D-葡萄糖产生葡萄糖酸和过氧化氢。随后，辣根过氧化物酶(HRP)催化过氧化氢与显色底物发生反应，然后采用分光光度计检测生成的有色物质。目前利用此原理进行GOD酶活力检测的方法主要有靛红褪色法、醌亚胺法、邻苯二胺法和邻联茴香胺法等。虽然分光光度法非常灵敏，但遗憾的是以上的方法在已报道的文献中存在着显色物质不稳定，数据重复性不好，标准曲线线性范围较窄以及检测GOD酶活力结果较低的情况，尚停留在定性分析的基础上，不适合进行推广和制定标准。因此，建立快速、准确、灵敏和检测成本低的GOD酶活力检测方法一直是研究工作者努力追求的目标。 

为了克服GOD酶活力检测体系的缺点，设计出快速可靠，操作简单，灵敏准确的检测方法，拓宽检测体系的适用范围，改正不合理的因素，本发明提供一种定性和定量测定葡萄糖氧化酶活力的方法，通过反复验证，建立了较为实用可靠的酶活力检测体系。 

发明内容

本发明的目的是提供一种定性和定量测定葡萄糖氧化酶活力的方法。 

根据本发明的快速测定葡萄糖氧化酶活力的方法包括以下步骤： 

(1)绘制过氧化氢浓度-邻联茴香胺显色剂吸光值标准曲线，先分别吸取过氧化氢标准溶液0.25mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL和0.75mL，分别用磷酸盐缓冲液定容至25mL，配成终浓度分别为24μg/mL～72μg/mL的过氧化氢浓度梯度系列，在试管中依次加入2.5mL邻联茴香胺稀释液、0.3mL葡萄糖溶液、0.1mL辣根过氧化物酶溶液，混匀后再分别加入上述不同浓度过氧化氢标准溶液各0.1mL，混匀后加入2mL 2mol/L的硫酸溶液，振荡均匀后在540nm处用1cm杯测定吸光值。以吸光值为横坐标，过氧化氢浓度为纵坐标绘制标准曲线； 

(2)对待测葡萄糖氧化酶样品进行预处理，以磷酸缓冲液稀释样品，稀释后的样品中葡萄糖氧化酶活力控制在0.8～2.8U/mL之间； 

(3)反应时，在试管中依次加入2.5mL邻联茴香胺稀释液、0.3mL葡萄糖溶液、0.1mL辣根过氧化物酶溶液，振荡均匀后在规定温度水浴5min后，测定管加入已稀释的酶样品溶液0.1mL，在规定温度反应3min后，加入2mol/L的硫酸溶液2mL终止反应，振荡均匀并冷却至室温后，在540nm处用1cm杯测定吸光值，以热失活的酶液做空白对照，利用过氧化氢浓度-吸光值标准曲线计算试验样品中葡萄糖氧化酶活力。 

GOD酶活力的检测原理如下所示： 

整个过程包括三个步骤： 

第一步，在水溶液中，在GOD的存在下，1molβ-D-葡萄糖和1mol分子氧反应生成1mol葡萄糖酸和1mol的过氧化氢； 

第二步，过氧化氢和无色的还原型邻联茴香胺在辣根过氧化物酶的作用下，生成水和棕色的氧化型邻联茴香胺； 

第三步，棕色的氧化型邻联茴香胺与硫酸溶液反应生成粉红色的氧化型邻联茴香胺。 

上述三步反应均在同一玻璃试管中进行，操作非常方便。