[发明专利]一种重组人促红素的无血清培养基，其应用以及重组人促红素的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体讲，涉及一种重组人促红素的无血清培养基，其应用以及重组人促红素的制备方法。

背景技术

促红细胞生成素(简称促红素Erythropoietin，EPO)是由肾脏和肝脏分泌的一种糖蛋白激素类内源性生理物质，能够促进自身红细胞的生成。1989年6月，美国FDA正式批准由安进公司研制的重组人促红素(r-HuEPO)上市，r-HuEPO由165个氨基酸组成，通过DNA重组技术获得。重组人促红素与人体内源性EPO具有相同的生理活性。重组人促红素，主要适应症为治疗因慢性肾衰所引起的贫血症、外科围手术期的红细胞动员，目前也有报道应用于治疗癌症病人接受化学药物治疗(简称化疗)引起的贫血、纠正多发性骨髓瘤(MM)相关的贫血、早产儿贫血和孕妇妊娠期及产后贫血、艾滋病患者治疗引起的贫血，类风湿关节炎、红斑狼疮及严重的寄生虫病患者的慢性贫血、骨髓增生异常综合性贫血、血红蛋白病的镰状红细胞贫血及地中海贫血、炎症性肠疾患相关性贫血。还可应用于增强运动耐力，减少高原反应和需输血的心绞痛患者。

重组人促红素是由基因重组的CHO细胞经过复苏、扩增培养和无血清培养后，无血清培养液经过过滤、超滤、多步层析纯化后制得。

重组人促红素由165个氨基酸组成的单链多肽和肽链上连接的糖基组成。分子量约为30，400道尔顿，其中肽链骨架约为18KD，肽链上有两个二硫键位于Cys7和Cys161，Cys29和Cys33之间；三个N-和一个O-糖基化位点位于Asn24、Asn38、Asn83和Ser126。肽链通过四个糖基化位点与四个富含唾液酸的糖链相连。基因重组CHO细胞的制备方法是，将EPOcDNA转染到CHO细胞后，经克隆筛选(ELISA法)，初选表达阳性的克隆细胞系，再MTX加压筛选，获得B₄、C₃、F₁₀、G₇、4个高表达EPO细胞系。对上述4系细胞系进行进一步检测，证实F₁₀细胞系无支原体污染。且表达量为四株中最高。对其进行亚克隆纯化，获得分泌量最高的F_10-6亚克隆株。对F_10-6细胞株做进一步亚克隆鉴定，共获得15个亚克隆系，分别测定表达EPO水平，结果15个亚克隆系表达EPO水平相差不大，说明F_10-6细胞株纯度可靠。

完全或部分失去唾液酸的重组人促红素，进入体液循环后，被肝脏中的半乳糖受体结合并迅速降解，从而影响其在体内的半衰期；二、四分枝糖链形式的rHuEPO其体内外活性有很大的区别，二分枝糖链的EPO的体内活性只有标准EPO的1/7，而体外活性却有其3倍。

为了进一步提高重组人促红素的活性，已公开一些现有技术：

专利申请201110265828.6公开了一种重组人促红素-CTP融合蛋白的生产工艺方法，其特点是重组工程细胞株的培养方式采用微载体悬浮灌注培养技术或无血清悬浮流加培养技术。

专利201110192509.7公开了一种用于CHO细胞表达促红素的无血清培养基以及CHO细胞中高效表达促红素的培养方法。无血清培养基中含有添加剂D-葡萄糖和正丁酸钠，还含有添加剂D-半乳糖、D-甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖中的一种或多种。

专利ZL201310116456.X公开了一种重组人促红素的工业化生产方法，包括扩增培养和分离纯化，扩增培养采用无血清培养基，无血清培养基为在DMEM中添加有2-4％Ultroser G和250-300mg/L正丁酸钠以及2-3mg/L核黄素形成的培养基。该发明在细胞培养时全程采用无血清培养。上述两种方法均采用罐培养技术，所需仪器复杂，投入成本高。

为了克服现有技术的缺陷，进一步提高重组人促红素的产量和活性，特提出本发明。

发明内容

本发明的首要发明目的在于提出了一种重组人促红素高表达高活性的无血清培养基。

本发明的第二发明目的在于提出了该重组人促红素的无血清培养基的应用。

本发明的第三发明目的在于提出了一种重组人促红素的制备方法。

为了实现本发明的目的，采用的技术方案为：

一种重组人促红素的无血清培养基，培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂中含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸、NaHCO₃和大豆蛋白水解液。