[发明专利]一种两阶段补料策略促进枯草芽孢杆菌持续表达伊枯草菌素的方法

说明书

技术领域

本发明属于提高伊枯草菌素产量技术领域，具体涉及一种两阶段补料策略促进枯草芽孢杆菌持续表达伊枯草菌素的方法。

背景技术

伊枯草菌素A是一种具有广谱抗真菌活性的环脂肽抗生素，其分子结构由七个氨基酸残基组成的肽链和一个β-氨基脂肪酸侧链(链长C14-C17不等)构成，可广泛用于防治各种作物的真菌病害，具有抑菌持久、稳定性好、不易产生抗药性和对环境安全等优点，是一种极具研究开发价值和应用前景的新型生物农药，近年来受到国内外广泛关注。然而，迄今为止，国内外均没有建立起良好的伊枯草菌素A及其同系物的发酵生产工艺，尤其是伊枯草菌素A及其同系物的液态发酵生产技术仍没有取得突破，其产量低、成本高，发酵工艺控制难度大，制约着其工业化生产和商业化应用。为了进一步提高伊枯草菌素的产量、降低生产成本，目前国内外大部分研究集中在菌种筛选、遗传改良、廉价原料的使用及培养营养和环境因子的优化等方面。利用补料速度控制策略提高伊枯草菌素的产量，尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种两阶段补料策略促进枯草芽孢杆菌持续表达伊枯草菌素的方法，利用本发明能实现伊枯草菌素的产量持续高效表达，整个发酵过程中无葡萄糖积累。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：一种两阶段补料策略促进枯草芽孢杆菌持续表达伊枯草菌素的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)菌株活化：先将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis3-10)(GeneBank登陆号：JF460845，由华中农业大学陈守文教授馈赠)转斜面在28℃培养箱中培养24小时，培养基为LB琼脂培养基，得到活化的枯草芽孢杆菌；

2)摇瓶培养：挑取活化的枯草芽孢杆菌单菌落于LB液体培养基中进行摇瓶培养14小时，温度为28℃，转速为220rpm；

3)发酵罐培养：将摇瓶培养的枯草芽孢杆菌在发酵培养基中(7L发酵罐中)进行发酵120小时，发酵条件为：接种量2％(v/v)(摇瓶培养的枯草芽孢杆菌体积为发酵罐初始发酵培养基体积的2％)，pH7.0，发酵通风比为2：1(vvm)(通风比为一分钟内通过单位体积发酵培养基的空气体积比)，搅拌转速600rpm；

所述发酵培养基组成：菜粕90g/L，葡萄糖20g/L，K₂HPO₄·3H₂O1g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，MnSO₄·H₂O0.005g/L，水1L；

4)当发酵过程中还原糖浓度降至3～4g/L时(发酵约48h)开始进行流加培养，流加培养基为：葡萄糖500g，水1L；流加培养过程采用两阶段控制策略，前期(发酵48-80h)葡萄糖的流加速率控制在0.56g/L/h，80h后将流加速度降至0.28g/L/h，直至发酵120h结束，取上清液，上清液经甲醇抽提后采用超高效液相色谱检查伊枯草菌素含量。

本发明发酵过程中使用廉价菜粕作为氮源，在细胞处在稳定生长期(发酵约48h)、还原糖浓度降至3-4g/L时开始补料；补料过程采用两阶段控制策略，补料前期(发酵48-80h)葡萄糖的流加速率控制在0.56g/L/h，80h后将流加速度降至0.28g/L/h，直至发酵120h结束。本发明的有益效果：利用本发明能显著提高伊枯草菌素(伊枯草菌素A)的产量，伊枯草菌素产量由0.57g/L提高到了1.12g/L。本发明的两阶段补料速度控制策略对脂肽和其它次级代谢产物的生产具有重要的指导和借鉴意义。利用此策略生产的伊枯草菌素可用于生物农药、医药等领域。

具体实施方式

实施例1：

一种两阶段补料策略促进枯草芽孢杆菌持续表达伊枯草菌素的方法，包括如下步骤：

1)菌株活化：先将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis3-10)(GeneBank登陆号：JF460845，由华中农业大学陈守文教授馈赠)转斜面在28℃培养箱中培养24小时，培养基为LB琼脂培养基，得到活化的枯草芽孢杆菌；

2)摇瓶培养：挑取活化的枯草芽孢杆菌单菌落于LB液体培养基中进行摇瓶培养14小时，温度为28℃，转速为220rpm；