[发明专利]氨基甲酸酯类农药降解酶CFH与其编码基因cfd以及二者的应用

说明书

技术领域

本发明属于应用环境微生物和农业领域，涉及能降解呋喃丹等氨基甲酸酯类农药的酶CFH与其编码基因cfd以及二者的应用。 

背景技术

我国人多地少，大量使用化学农药是保证作物高产稳产的必要措施，但同时也带来严重污染。农药的难降解性，导致土壤和农产品残留率较高，如目前在长三角和珠三角农田土壤检出率达90％以上，受农药污染的农产品更是如此，如国际绿色和平组织2009年检测结果表明，我国90％农产品检出农药残留，66％的样品残留至少5种以上农药，2010年4月份发生的青岛毒韭菜事件就是有机磷杀虫剂污染导致的，造成了恶劣影响。生物(酶)降解技术是一种新型原位生物修复技术，具有效果好、费用低和无二次污染等特点，是降解土壤和农产品上农药残留的理想方式。 

呋喃丹等氨基甲酸酯类农药是一类在世界范围内应用广泛的杀虫剂。该类农药毒性作用机理与有机磷农药相似，主要是抑制胆碱酯酶活性。氨基甲酸酯类农药可经呼吸道、消化道侵入机体，也可经皮肤粘膜缓慢吸收，主要分布在肝、肾、脂肪和肌肉组织中。近年来，由于其高毒性以及频繁发生的农药中毒事件，部分品种被世界各国限用，甚至禁用。以呋喃丹为例，欧盟和加拿大已禁用，美国禁用于任何作物(人食用)；2014年版的中国国家禁用和限用农药名单中，呋喃丹属于限用农药，蔬菜、果树、茶树、中草药材是其禁止使用的范围。这也就意味着呋喃丹等氨基甲酸酯类农药仍然在被大量使用，其在土壤和农产品中残留是依然我们要面对和解决的问题。 

要利用生物(酶)降解技术解决氨基甲酸酯类农药残留问题首先要获得优良的菌株和基因资源。目前能够降解该类农药的微生物已有较多报道，但是相应的基因资源却报道很少。目前共有三个相关的基因cehA(GenBank登陆号：AB069723)、cahA(GenBank登陆号：AB081302)和mcd，前两个基因编码的降解酶只对西维因有较强活性，mcd的序列虽然可以从GenBank(登陆号：AF160188)中获得，但并未有直接的文献报道，相关文献只报道了其出发菌株、酶的纯化和基因的定位。因此，至今还没有针对氨基甲酸酯类农药的广谱、高效降解酶基因的报道。这限制了人们利用生物(酶)降解技术消除土壤和农产品上的氨基甲酸酯类农药残留。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供呋喃丹等氨基甲酸酯类农药降解酶CFH与其编码基因cfd以及二者的应用。基因cfd可用于构建降解氨基甲酸酯类农药的转基因微生物或植物，亦可用于生产降解氨基甲酸酯类农药的酶制剂，用于消除土壤、水体和农产品中氨基甲酸酯类农药残留。 

本发明的目的可通过如下技术方案实现： 

一种氨基甲酸酯类农药降解酶基因cfd，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。 

基因cfd的出发菌株鞘氨醇杆菌(Sphingobium sp.)YBL3保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M208076。质谱分析结果表明菌株YBL3的粗酶液可以把呋喃丹、西维因和异丙威等氨基甲酸酯类农药的酰胺键断裂而降解这些农药，消除其毒性。 

克隆氨基甲酸酯类农药降解酶基因的策略为鸟枪法。首先提取菌株YBL3的总DNA，总DNA采用Sau3AI部分酶切后和BamHI用酶切的质粒pUC118酶连，酶连产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞获得总DNA文库。用高效液相色谱(HPLC)检测法筛选出能够降解呋喃丹的克隆，然后将用降解能力的克隆测序、分析，确定目标基因的开放阅读框(ORF)。最后获得目标基因的开放阅读框大小为2139bp，命名为cfd，其编码的酶命名为CFH。这是首次针对氨基甲酸酯类农药的广谱、高效降解酶基因的报道。 

所述cfd基因所编码的酶CFH，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。 

含有所述cfd基因的重组表达载体。 

所述的重组表达载体优选将所述cfd基因插入pET-29a(+)的NdeI和EcoRI位点之间所得 

含有所述cfd的基因工程菌。 

所述的基因工程菌的出发菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。 

所述cfd基因在构建降解氨基甲酸酯类农药的转基因作物中的应用。 

所述cfd基因在去除农产品、土壤和水体中氨基甲酸酯类农药残留中的应用。 

所述降解酶CFH在降解氨基甲酸酯类农药中的应用。 

所述降解酶CFH在去除农产品、土壤和水体中氨基甲酸酯类农药残留中的应用。