[发明专利]高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法

权利要求书

1.一种高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)无菌幼胚的获取：剪取花后20～30天的整串刺葡萄幼果，去除果穗和果柄，置入加有洗涤剂的自来水中浸泡30min，冲洗干净，自然晾干；将幼果用75％酒精浸泡30s，接着用0.1％升汞溶液灭菌15min，再用无菌水冲洗5次，最后将灭菌好的刺葡萄幼果，小心切开，取出完整的幼胚；

(2)启动培养：取所述幼胚，将该幼胚以平放的方式接种至诱导愈伤组织的诱导培养基中，然后于培养室中黑暗条件下培养35天，得到初代愈伤组织；

(3)增殖培养：将初代愈伤组织转接到继代增殖培养基中，并于温度23～25℃，光照强度1000～1500lx，每天光照10h的条件下进行继代增殖培养，直至获得生长一致且生长旺盛的刺葡萄愈伤组织；

(4)筛选：从步骤(3)所获得的刺葡萄愈伤组织中，选取质地松脆、颜色为紫红色的刺葡萄愈伤组织，剥去紫红色表层，选取里层的愈伤组织接种至附加1.5mg/L2,4-二氯苯氧基乙酸的MS固体培养基中，于温度23～25℃，光照强度1000～1500lx，每天光照10h的条件下培养20～25天，获得高产原花青素的愈伤组织；

(5)长期继代保持：以培养20～25天的高产原花青素的愈伤组织为材料，于温度23～25℃，光照强度1000～1500lx，每天光照10h的条件下，采用两种继代保持培养基交替继代培养，并采用剥去所述愈伤组织紫红色表层细胞，选里层愈伤组织接种的方式，能长期继代保持高产原花青素的紫红色刺葡萄愈伤组织。

2.如权利要求1所述的高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法，其特征在于：所述步骤(2)中的诱导培养基为：MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，或MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.0mg/L+6-糠氨基嘌呤0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。

3.如权利要求1所述的高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法，其特征在于：所述步骤(3)中的继代增殖培养基为：MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，或MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.5mg/L+6-糠氨基嘌呤0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。

4.如权利要求1所述的高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法，其特征在于：所述步骤(5)中的两种继代保持培养基为：MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，以及MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.5mg/L+6-糠氨基嘌呤0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。