[发明专利]负载生长因子壳聚糖微球的DBM支架修复关节软骨材料

权利要求书

1.一种负载生长因子壳聚糖微球的DBM支架修复关节软骨材料，其特征在于按以下方法制备而得：

1 ）DBM的制备:采用猪新鲜肩胛骨，剔除骨膜、软骨及软组织，取其松质骨，制备成圆饼形状，反复流水搅拌冲洗清除骨髓、血污及表面油脂，自来水冲洗后，置-80℃保存3d,然后依次进行以下步骤：

（1）无水乙醇脱水2h，风干；

（2）氯仿/甲醇1:1，体积分数，脱脂4h,风干；

（3）0.6mol/L盐酸分别脱钙6h，盐酸/松质骨：20ml/g，风干；

（4）无水乙醇脱水2h，风干；

（5）氯仿/甲醇1:1，体积分数，脱脂4h,风干；

（6）10%PBS,pH=7.4,37℃浸泡3d，中间换液2次，风干；

（7）75%医用酒精消毒，4℃保存备用；

（8）肉眼及扫描电镜下观察；

2 ）壳聚糖缓释微球的制备：分子量100K、脱乙酰度95%的壳聚糖120mg，加入4ml 2% v/v 醋酸，全部溶解后，滴加到120ml含4% v/v 司盘80的正辛醇，1500rpm/min搅拌30min，加入10ml 10% w/v TPP溶液，再1500rpm/min搅拌30min后，4000rpm离心收集微球，分3层，由上而下是正辛醇，水和微球，在抽滤装置中，用异丙醇和水各洗3次，冷冻干燥，肉眼观察及扫描电镜；

3 ）包裹生长因子微球制备、包封率与载药量计算：

（1）lmg壳聚糖微球与 20ng/ml生长因子15μL，ph=7.4时在4℃充分侵润、膨胀24h；

（2）收集离心上清液，上清液以PBS定容100ml,取10μL另加90μLPBS液作为待测样品，微球冷冻干燥备用；

（3）按生长因子ELISA试剂盒说明书，酶标仪于495nm测定吸光度，按标准曲线计算载药量与包封率；

4）DBM载生长因子-壳聚糖缓释微球复合体的制备：

(1)先将DBM称重后装入EP管，再装入包裹生长因子聚糖微球；

(2)将装满微球及DBM的EP管置超声波清洗器内，震荡2小时；

(3)超声完毕，去掉DBM表面的微球，然后称重，计算DBM所载微球的量，并且调整每个DBM含微球量相等；

(4) 称取2gEDC（Carbodiimide，碳化二亚胺）,溶于100ml双蒸水中，配置成0.02% 浓度的EDC溶液，取一块六孔板，取一孔放入适量的配置好的EDC溶液，把制备好的DBM/微球支架浸润在里面；

(5)放置在4℃冰箱内反应24h，取出后，用PBS液洗涤3次，自然风干；

(6)将上述DBM/微球支架大体观察并电镜扫描，观察形貌；

(7)通过红外线法测定DBM支架和微球用EDC交联后酰胺键连接。