[发明专利]5-氟胞嘧啶作为蛋白质染色剂的用途

说明书

某些氨基酸(如色氨酸等)会与嘧啶碱基发生光解加成反应而放出可见荧光。5‑氟胞嘧啶作为一种新型的蛋白质染色剂，可以在5分钟内完成对蛋白条带的可见荧光检测。蛋白质中的色氨酸在紫外光诱导下和5‑氟胞嘧啶反应产生可见荧光的蛋白条带。本专利研究表明，5‑氟胞嘧啶作为蛋白质新型染色剂可以减少染色步骤，凝胶电泳结束后取出凝胶并放在紫外激发台上可以在5分钟内看到荧光蛋白条带，完成对蛋白的初步检测工作；另外，快速可视化方法可以看到78ng的总蛋白量检测灵敏度等同于考马斯亮蓝(CBB)染色法；并且凝胶在观察后还可以进行CBB染色，实现对蛋白质的互补检测；此外，凝胶可视化操作后还可以进行后续的蛋白免疫印迹检测等实验操作并无不良影响。

技术领域

本发明涉及5-氟胞嘧啶的新用途，尤其涉及5-氟胞嘧啶作为蛋白质染色剂的新用途，属于5-氟胞嘧啶的应用领域。

背景技术

蛋白质组学（proteomics）是指以基因组编码的所有蛋白质为研究对象，从细胞水平及整体水平上研究蛋白质的组成及其变化规律，从而深入认识有机体的各种生理和病理。与传统蛋白质研究比较，蛋白质组学研究体现了全面性、整体性、高通量、大规模的特点。蛋白质组学的研究对于已完成基因组计划的理论预测的蛋白质组进行实证分析具有无法替代的重要作用。蛋白质组学技术较为复杂，包括蛋白质分离、鉴定和信息分析三方面的内容。其中，凝胶电泳是与分离和鉴定相对应的核心技术之一。

自1959年Raymond和Weintraub首次使用聚丙烯酰胺作为电泳的支持介质，特别是20世纪60年代初Hjerten、Ornstein和Davis发表不连续电泳系统的基础工作以来，聚丙烯酰胺凝胶已成为目前生化实验最常用的支持介质，通过使用强阴离子SDS建立的SDS-PAGE技术已成为蛋白质分离、分析的常用方法。为了确定多肽链的分子量，就必须在有阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠的存在下进行蛋白电泳。这种去污剂不仅可以完全打开蛋白质的折叠结构，而且可以和未折叠的肽链结合产生恒定的电荷密度。这意味着可以只依据蛋白质分子量对蛋白质进行分离。并通过与已知分子量的蛋白标准品进行比对而得知未知蛋白的分子量。

而在蛋白质组学而在蛋白质组学试验中，蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳后的染色是一个十分重要的环节。常用的蛋白质染色方法有考马斯亮蓝染色、银染、荧光染色等。其中，考马斯亮蓝（CBBR和CBBG）染色是最常用的蛋白质染色方法，它具有成本低、操作便捷及质谱兼容性好等特点。但是此方法通常涉及到几个小时的蛋白质固定，染色和脱色过程。并且染色和脱色试剂都具有腐蚀性和刺激性气味，考马斯亮蓝的蓝色染色沾染在操作仪器等物品上也很难消除，除此之外，经过染色剂染色的聚丙烯酰胺凝胶也无法再进行下游相关的蛋白质检测操作。银染是目前公认的除了放射性标记以外最为灵敏的蛋白质检测方法，可以在纳克级水平上检测蛋白。但是，银染通常会有相对低的重复性，造成很高的背景，并且由于加入的戊二醛和甲醛会对蛋白质进行修饰，导致银染的后续蛋白质组学研究的兼容性能普遍不佳。最近发展以来的荧光染色技术有很高的灵敏度和后续蛋白质组学研究兼容性。但由于荧光染料价格昂贵，且极易淬灭，还需要高端的仪器设备和特殊的分析软件，限制了该项技术在蛋白质组学领域的广泛应用。

Western blot凝胶电泳是后续的蛋白质组学研究技术之一，其主要是用来识别、量化、并确定特定蛋白的大小。Western blot是由Northern blot和Southern blot演化而来。在20世纪70年代后期，Towbin等人（1979年）使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，并转移到硝酸纤维素膜上。Burnette等人（1981年）使用应用广泛的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质，这最终将这种方法被称为Western印迹。它也被称为蛋白质印迹或免疫印迹，并迅速成为蛋白质组学研究的有力工具。Western blot的方法是先用凝胶电泳分离天然或变性的蛋白质，然后将蛋白质转移到膜上，用未标记的特异性一抗与转移到膜上的抗原结合，再加入标记（酶、荧光、生物素等标记）的二抗进行免疫检测，存在检测步骤多、成本高等缺陷，有待改进。

发明内容