[发明专利]一种肺癌差异性表达microRNA的检测试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种肺癌差异性表达microRNA的检测试剂盒及其应用。检测试剂盒包括引物、内参基因和阴性对照；所述引物的正向引物的碱基序列如SEQ ID No.42～82所示中的至少一种，反向引物的碱基序列如SEQ ID No.83所示。本发明发现SEQ ID No.1～41所示的miRNA分子在肺癌组织、癌旁组织以及正常组织中均存在差异性表达，且差异性表达显著，可用作肺癌诊断标记物，并针对miRNA分子设计了相应的引物以及含有该引物的试剂盒，通过对样品进行实时荧光定量PCR，检测该样品中是否存在差异性表达miRNA，即可对该样品所属个体是否患有肺癌进行初步判断，为临床诊断和预后提供参考。

技术领域

本发明属于医药生物领域，具体涉及一种肺癌差异性表达microRNA的检测试剂盒及其应用。

背景技术

肺癌已成为世界范围内最主要的肿瘤死亡原因，大约31％与癌症相关的死亡是由肺癌造成的。早期诊断是降低癌症患者死亡率的关键因素。目前的临床诊断手段对发现早期肺癌并不十分有效，3/4的病人在确诊时肺癌已发生转移。另外，由于肺癌的多样性和复杂性，许多肺癌患者的发展和治疗结果与临床分期极不相符，导致同期的癌症患者在接受相同的治疗措施后，预后效果却差异很大。因此寻找早期肺癌诊断以及分子分型的临床分子标记物成为当务之急，是急需解决的重大科学问题。

现有的临床诊断技术远不能满足早期诊断的需要。早期的X光仅能发现直径在1cm以上的瘤块，CT扫描及B超检查，可检出直径在0.5cm左右的肿瘤，MRI和PET检查，可以发现更小的肿瘤组织，但其特异性低，仍需要病理活检的辅助才能明确诊断。支气管镜、胃镜、膀胱镜等内窥镜的使用，极大地提高了肺癌、消化系统肿瘤及膀胱癌等的诊断率，但均为介入性检查，对患者的损伤和痛苦大，且对操作者技术要求高，价格昂贵，不适用于大规模的人群筛选普查。因此，寻找正确、可靠的、无创伤的肿瘤早期诊断方法成为当务之急。早期诊断肿瘤最快速的方法是通过检测和分析血液中的肿瘤标记物。这些分子标记物并不局限于原发肿瘤所处的位置，而且较易采集，在肿瘤的早期诊断和预后等方面发挥着重要作用。

目前，人类发现的血清标记物已有百余种，但由于肿瘤的多样性和复杂性，特异性强、具有明确诊断作用的标记物并不多。临床常用的仅20多种，能用于大规模人群普查的肿瘤标记物更少。美国食品医药管理局(FDA)批准的生物指标如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)和前列腺特异抗原(PSA)等，对肝癌、结肠癌及前列腺癌诊断的特异性和敏感性都较低，无法达到诊断肿瘤的指标，只能作为诊断的辅助指标或者与其他临床参数一起作为判断患者预后的参考指标。

研究发现，循环miRNA不仅能有效区分正常个体和肿瘤病人，而且能正确评估肿瘤的恶性程度。血浆miR-92用于结直肠癌的分子诊断，其灵敏度可达89％，特异度达到70％，肿瘤切除后血浆miR-92的表达水平较术前显著降低。血清miR-21的浓度不仅能区分乳腺癌病人和健康个体，而且能区分乳腺癌早期和晚期病例。

近几年来，随着对miRNA研究的深入，人们发现循环miRNA不仅具有良好的稳定性，而且具有显著的肿瘤相关性和组织特异性，这些研究奠定了循环miRNA作为肿瘤生物标记物的理论基础。细胞中miRNA能在转录后水平调控靶基因表达和蛋白质翻译，广泛参与各种正常的生命过程，其功能失调与肿瘤的发生、发展密切相关。然而多数循环miRNA的生成机制、生物学功能以及与相关肿瘤的关系目前尚不明确。

发明内容

本发明提供了一类用作肺癌诊断标记物的miRNA，该miRNA在肺癌组织中存在差异表达。

本发明利用miRNA基因芯片(TaqMan MicroRNA Array(human A+B板3.0)技术对临床收集的正常肺组织和肺癌组织标本进行分析，筛选出在肺癌组织中表达均异常且有明显上升趋势的118种miRNA分子。然后利用实时荧光定量PCR对筛选得到的118种miRNA分子进行验证和进一步筛选，从中得到了41种miRNA分子。