[发明专利]快速筛选香蕉抗病相关基因的细胞模型

说明书

技术领域

本发明属于基因功能研究领域，特别涉及一种快速筛选香蕉抗病相关基因的细胞模型。

背景技术

由于病虫害日益猖獗，香蕉生产面临着严峻的考验，培育并种植抗病品种被认为是防治病虫害的最经济、最有效的措施，是香蕉产业可持续发展的保证。克隆香蕉的抗病相关基因并进行功能研究既是香蕉遗传改良的重要基础，也是揭示抗病机制的必要环节。在进行香蕉抗病功能基因研究时，当克隆到一个基因后，一般先对它进行表达分析，以确定该基因是否与香蕉抗病反应相关。目前，通过基因表达分析筛选香蕉抗病相关基因的方法主要是：将香蕉组培苗移栽后，人工接种病原菌，于不同时间取材，分别提取RNA，然后采用半定量RT-PCR、实时荧光定量PCR或Northern杂交技术分析目的基因的表达模式。现有的获得用于进行基因表达分析筛选香蕉抗病相关基因的植物材料的方法是将香蕉组培苗移栽网/温室，待张出6～8片展开叶片后，分别人工接种病原菌，于不同时间取材。这一方法涉及到香蕉植株种植，需要耗费比较多的人力、物力、财力、时间和空间，而且取材结束后对接种了病原菌的剩余植株、土壤和容器等的灭菌处理也非常耗时耗力。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种快速筛选香蕉抗病相关基因的细胞模型。本发明利用香蕉抗病和感病品种的悬浮培养细胞与病原菌粗毒素模拟寄主与病原菌的相互作用，在其相互作用下，香蕉抗病反应的正调控基因的激活表达在抗病品种的细胞中比感病品种的细胞中更强、更快或持续时间更长，而香蕉抗病反应的负调控基因的表达抑制在抗病品种的细胞中比感病品种的细胞中更强烈。表达模式既有差别就可以通过实时荧光定量PCR技术筛选出香蕉抗病相关基因。本发明利用细胞培养技术操作在时间和空间上的优势，通过实时荧光定量PCR技术分析目的基因在抗病品种和感病品种的细胞中的表达差异，从而确定目的基因对香蕉抗病性的影响，为香蕉抗病相关基因的筛选提供了一种省时省力、快速有效的新方法。

本发明的再一目的在于提供所述快速筛选香蕉抗病相关基因的细胞模型的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种快速筛选香蕉抗病相关基因的细胞模型，其制备方法包括如下步骤：

(1)病原菌培养，诱导产生病原菌毒素，将病原菌毒素分离提取，得到病原菌粗毒素，贮存备用；

(2)将步骤(1)中得到的病原菌粗毒素分别加入香蕉抗病和感病品种的悬浮细胞培养系统，诱发香蕉细胞抗病反应，并分别收集香蕉细胞，即建立了可用于快速筛选香蕉抗病相关基因的细胞模型。

步骤(1)所述的病原菌包括导致香蕉病害的真菌、细菌或病毒等；

步骤(1)中所述的病原菌优选为香蕉枯萎病菌4号生理小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense race4，FOC race4)；

步骤(1)中所述的诱导的条件优选为每40～60mL马铃薯液体培养基中接种一块病原菌菌丝体，于24～26℃持续光照条件下，120～150rpm振荡培养10～14天；

所述的病原菌菌丝体优选为病原菌于马铃薯固体培养基上，24～26℃光照培养6～8天，切取面积1～1.5cm²的菌丝体；

步骤(1)中所述的分离的条件优选为将诱导后所得菌液首先使用4层灭菌纱布过滤，再经双层滤纸过滤收集培养滤液；取100mL培养滤液以8000rpm离心15min，取上清液于旋转蒸发仪中，50℃旋转蒸发浓缩至10mL，用等体积乙酸乙酯萃取，收集水相，再用乙酸乙酯重复萃取2次；最后收集到的水相于50℃旋转蒸发浓缩，用蒸馏水稀释至50mL，即得到病原菌粗毒素；

步骤(2)中所述的病原菌粗毒素，与悬浮细胞培养系统优选按体积比1:19.5的比例混合；

步骤(2)中所述的悬浮细胞培养系统由香蕉悬浮细胞的细胞沉淀和香蕉细胞悬浮培养基按体积比0.5:19比例混合；

所述香蕉细胞悬浮培养基组成为：以MS培养基为基本培养基，添加1mg/L生物素、100mg/L谷氨酰胺、100mg/L麦芽提取物、1mg/L2,4-二氯苯氧乙酸和45g/L蔗糖，高压灭菌前pH为5.3；

所述的香蕉悬浮细胞的细胞沉淀优选通过如下步骤制备；分别取在香蕉细胞悬浮培养基中继代培养3～5天的大蕉和巴西蕉悬浮细胞，4000～5000rpm离心8～10分钟，去上清，即得细胞沉淀；

步骤(2)中所述的诱发香蕉细胞抗病反应的条件优选为26±1℃，90～110rpm黑暗振荡培养；