[发明专利]一种检测巴贝西虫的方法及其专用试剂盒

权利要求书

1.一组DNA分子，由如下(1)-(3)所示的DNA分子组成：

(1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

(2)SEQ ID No.3所示的DNA分子；

(3)SEQ ID No.4所示的DNA分子。

2.一种检测样品中巴贝西虫含量的试剂盒，该试剂盒包含如下(1)-(4)所示的分子：

(1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

(2)SEQ ID No.3所示的DNA分子；

(3)SEQ ID No.4所示的DNA分子，或5’端连接报告荧光基团，3’端连接淬灭荧光基团的SEQ ID No.4所示的DNA分子；

(4)SEQ ID No.5所示的DNA分子。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述巴贝西虫为双芽巴贝西虫(B.bigemina)、猎户巴贝西虫(B.venatorum)、分歧巴贝西虫(B.divergens)和/或鹿巴贝西虫(B.capreoli)。

4.一种检测样品中巴贝西虫含量的方法，包括如下步骤：以不同浓度的含有SEQ IDNo.5所示DNA片段的重组质粒为模板，以SEQ ID No.2所示的DNA分子和SEQ ID No.3所示的DNA分子为引物，以5’端连接报告荧光基团，3’端连接淬灭荧光基团的SEQ ID No.4所示的DNA分子为探针，进行实时荧光定量PCR扩增，以每个反应中重组质粒的拷贝数为横坐标，对应的Ct值为纵坐标，制作标准曲线，得到标准曲线公式；提取待检样品的DNA，以其为模板，按照上述方法，得到对应的Ct值，记作A；将A带入标准曲线公式，得到重组质粒的拷贝数，即为待检样品中的巴贝西虫含量；

所述SEQ ID No.3所示的DNA分子为四种引物的等浓度混合物；

所述报告荧光基团具体为FAM，所述淬灭荧光基团具体为TAMRA；

所述巴贝西虫为双芽巴贝西虫(B.bigemina)、猎户巴贝西虫(B.venatorum)、分歧巴贝西虫(B.divergens)和/或鹿巴贝西虫(B.capreoli)；

所述方法为非疾病诊断和治疗的方法。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述重组质粒为将SEQ ID No.5所述的DNA分子插入pMD18-T得到。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的反应体系如下：2×Premix Ex Taq 10ul、浓度为10uM的SEQ ID No.2所示的DNA分子0.8ul、浓度为10uM的SEQ ID No.3所示的DNA分子0.8ul、浓度为10uM的5’端连接报告荧光基团，3’端连接淬灭荧光基团的SEQ ID No.4所示的DNA分子0.4ul、模板2.5μL、ddH₂O 5.5ul；所述实时荧光定量PCR的反应程序如下：95℃10min；95℃15s，60℃30s，45个循环；50℃5min；

所述2×Premix Ex Taq购自宝生物工程(大连)有限公司，货号为DRR039A。

7.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述标准曲线的制作过程中所述模板的浓度为4.4-4.4×10⁴拷贝数/微升。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述标准曲线的制作过程中所述模板的浓度为4.4、44、4.4×10²、4.4×10³、4.4×10⁴拷贝数/微升。

9.权利要求1所述的DNA分子或权利要求2或3所述的试剂盒在制备检测巴贝西虫的产品中的应用；所述巴贝西虫为双芽巴贝西虫(B.bigemina)、猎户巴贝西虫(B.venatorum)、分歧巴贝西虫(B.divergens)和/或鹿巴贝西虫(B.capreoli)。