[发明专利]建鲤管家基因18sRNA基因部分序列克隆方法及其real time PCR方法

说明书

 

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种建鲤管家基因18sRNA基因部分序列克隆方法及其real time PCR方法。

 

背景技术

在实时定量PCR (real time PCR)中，目标基因的相对表达量是通过管家基因表达量的均一化来确定。理想的管家基因应该是它的表达量不受实验条件影响，而且在各个组织中表达量恒定。大量的研究表明，目前还没有哪个管家基因符合这一条件，最好的管家基因就是其表达量在自己所研究的样品中变化量最小。18S rRNA 为核糖体rRNA，由45S rRNA加工而成，经核孔入胞质形成小亚基，参与蛋白质的合成。该基因在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的表达量一般是恒定的，故被广泛用作real time PCR中的管家基因。

在用Trizol提取的RNA样品中，不可避免的会有少量的DNA残留，通过DNAse酶处理去除DNA，反转录后，real time PCR扩增的模板仅为cDNA。另外再设计特异的引物，优化反应条件，达到理想的扩增效率，为后续的建鲤功能基因研究提供参考。

建鲤(Cyprinuscarpio var. jian)是本中心培育出的遗传性状稳定的鲤鱼新品种，具有生长快、体型佳、肉质好等优良的经济性状，已遍及我国27个省。但是目前还没有针对建鲤通过研究18sRNA作为管家基因，并利用real time PCR对建鲤功能基因进行研究。

 

发明内容

发明目的：本发明目的之一在于克隆出建鲤18sRNA基因的部分序列；本发明目的之二在于基于获得的序列，设计一对特异的real time PCR引物，建立基于SYBR Green I染料技术的建鲤18sRNA real time PCR方法，从而为18sRNA作为管家基因，在利用real time PCR对建鲤功能基因的研究中提供有用的方法。

 

技术方案：

本发明是通过以下技术手段实现的：

一种建鲤18sRNA基因的部分序列的克隆方法，按照以下步骤进行：建鲤血液基因组DNA提取，设计引物、PCR扩增，产物纯化，转入T载体，转化入感受态细胞，筛选蓝白斑，质粒测序，其中所设计的引物序列如下，其中正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQ ID NO.2所示；克隆得到的建鲤18sRNA基因部分序列为SEQ ID NO.3所示。

所述的建鲤18sRNA基因的部分序列的克隆方法，PCR扩增的反应条件为：95℃ 3min；30循环，每个循环的条件可以为 94℃、15s，58℃、20s，72℃、30s，循环完以后72℃延长6min；4℃度保存。

一种real time PCR扩增以上所述建鲤18sRNA基因部分序列的方法，按以下步骤实现：抽提总RNA，反转录，然后以反转录产物为模板进行real time PCR，荧光染料为SYBR Green I，其中real time PCR中的建鲤特异引物序列中正向序列如SEQ ID NO.4所示，反向序列如SEQ ID NO.5所示。

以上所述的real time PCR扩增所述建鲤18sRNA基因部分序列的方法，其中所述real time PCR扩增的反应条件可以为：94℃ 3min，40个循环 每个循环条件为94℃、5s，62℃、20s，最后72℃3min，4℃保存。

 

有益效果

本发明通过克隆建鲤18sRNA的部分序列，然后设计特异的real time PCR引物，优化扩增反应条件，提高了扩增效率。这样，可为18sRNA作为管家基因，在利用real time PCR对建鲤功能基因的研究中提供有用的方法。

 

附图说明

图1为实施例1目的基因鉴定电泳图，其中M为marker，1为目的条带。

图2为18sRNA溶解曲线图；

图3为18sRNA标准曲线图。

 

具体实施方式：

实施例1  建鲤18sRNA基因的部分序列的扩增

建鲤来自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴养殖基地，根据GenBank上公布的斑马鱼18sRNA基因的DNA序列设计一对引物，引物序列见表1。

表1 扩增建鲤18sRNA的引物