[发明专利]建鲤管家基因18sRNA基因部分序列克隆方法及其real time PCR方法无效
| 申请号： | 201410221021.6 | 申请日： | 2014-05-23 |
| 公开（公告）号： | CN103993006A | 公开（公告）日： | 2014-08-20 |
| 发明（设计）人： | 唐永凯;李红霞;李建林;俞菊华 | 申请（专利权）人： | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 南京经纬专利商标代理有限公司 32200 | 代理人： | 李纪昌 |
| 地址： | 214081*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 管家 基因 18 srna 部分 序列 克隆 方法 及其 real time pcr | ||
1.一种建鲤18sRNA基因的部分序列的克隆方法，按照以下步骤进行：建鲤血液基因组DNA提取，设计引物、PCR扩增，产物纯化，转入T载体，转化入感受态细胞，筛选蓝白斑，质粒测序，其特征在于，所设计的引物序列如下，其中正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQ ID NO.2所示；克隆得到的建鲤18sRNA基因部分序列为SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的建鲤18sRNA基因的部分序列的克隆方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：95℃ 3min；30循环，每个循环的条件为 94℃、15s，58℃、20s，72℃、30s，循环完以后72℃延长6min；4℃度保存。
3.一种real time PCR扩增权利要求1中所述建鲤18sRNA基因部分序列的方法，其特征在于，按以下步骤实现：抽提总RNA，反转录，然后以反转录产物为模板进行real time PCR，荧光染料为SYBR Green I，其中real time PCR中的建鲤特异引物序列中正向序列如SEQ ID NO.4所示，反向序列如SEQ ID NO.5所示。
4.根据权利要求3中所述的real time PCR扩增权利要求1中所述建鲤18sRNA基因部分序列的方法，其特征在于，所述real time PCR扩增的反应条件为：94℃ 3min，40个循环 每个循环条件为94℃、5s，62℃、20s，最后72℃3min，4℃保存。
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