[发明专利]一种使用薄层色谱板检测黄酒中生物胺的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种使用薄层色谱板检测黄酒中生物胺的方法，尤其是一种使用薄层色谱法定性、定量检测黄酒中生物胺的种类及含量的方法，属于黄酒成分分析检测技术领域。

背景技术

黄酒是我国特有的发酵酒，堪称东方酿造界的典型代表。但其发酵过程复杂且难以控制，因此黄酒酒液中含有丰富而复杂的成分，包括水分、乙醇、糖类、有机酸、含氮化合物、总固形物、不挥发酯、挥发性成分(包括醇、酸、酯、羟基化合物)、有机成分等。其中含有的氨基酸种类高达18种，总含量是其他酒种(啤酒、葡萄酒、白酒)氨基酸含量的一倍至数倍。氨基酸可被微生物代谢形成生物胺等潜在的有害成分，使得黄酒的安全性受到质疑。黄酒中的生物胺(尤其是组胺)越来越多的受到消费者、制造商和研究者的关注，因此加强黄酒中生物胺的监测对提高黄酒品质和安全性具有重要意义。

一些研究已经确认来自不同地区的黄酒中存在生物胺，并对黄酒中生物胺的种类及含量进行了检测分析。目前，黄酒中的生物胺主要是通过高效液相色谱法进行检测。高效液相色谱法技术虽然精确、灵敏，但既昂贵又费时，且一次只能完成1种样品的检测，远远不能满足实际生产中高通量、便宜、简便、快速的检测要求。在原有分析检测方法的基础上，亟需发明一种费用低、操作简单、可同时实现多个样品检测的方法。

薄层色谱法(thin-layer chromatography，TLC)是一种基于视觉光斑强弱的简单、半定量的方法，不需要重型或昂贵的设备，且允许对多个样品进行同时分析。本发明首次成功地应用薄层色谱法定性和定量地分析了黄酒中的生物胺，并对方法的准确性和精确性进行了验证，表明该方法是一个有效替代HPLC的检测分析方法。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种使用薄层色谱板检测黄酒中生物胺的方法，尤其是一种运用薄层色谱法定性、定量检测黄酒中生物胺种类及含量的方法。由于生物胺分子中缺少发色基团，本身既无紫外吸收、又无荧光及电化学活性，使得各类生物胺的分离及测定非常困难，所以本发明方法利用衍生化试剂对黄酒样品中的生物胺进行衍生，使其带上发光基团，然后在薄层色谱硅胶板上点样，用一定比例的展开剂展开，从而可在紫外或者荧光灯下定性检测，采用薄层色谱分析仪对相应的生物胺进行定量。

本发明的技术方案主要包括以下步骤：

(1)称取适量生物胺标品用0.1mol/L的盐酸定容，制成母液备用；称取适量丹磺酰氯溶于丙酮制备成1-10mg/mL的衍生化试剂备用；

所述生物胺包括尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺、腐胺、色胺等；

(2)不同浓度的生物胺标准溶液的配制：10-400μg/mL酪胺、亚精胺标准溶液；5.0-200μg/mL精胺标准溶液；20-800μg/mL组胺、腐胺标准溶液；40-1000μg/mL尸胺标准溶液；

(3)衍生：分别取等体积的待衍生标准溶液及黄酒样于不同的塑料离心管中，在每个离心管中加入一定体积的饱和NaHCO₃溶液使之呈碱性，再加入1-5倍样品溶液体积的衍生化试剂，在涡流混合器上涡旋混匀，置于黑暗恒温水浴锅中衍生，取出；在室温下放置几分钟后，加入1/2样品溶液体积的饱和NaCl溶液，再加入与样品溶液等体积的有机溶剂萃取，待分层后取上层有机相在薄层硅胶板上点样；所述衍生温度为25℃～60℃，衍生时间为10～60min；

(4)点样、分离：在硅胶薄层玻璃板上进行衍生样品的分离，样品从距板的底部10mm处开始点样，试样之间的距离至少15mm；

(5)展开：在分析之前，层析缸需要用展开剂混合物饱和，然后将点样后的硅胶薄层玻璃板置于装有展开剂的薄层室中展开，混合物从盘的底部升到约19cm处停止，干燥；

(6)显色：在紫外灯下显色，与混合标准样品进行比对，定性分析黄酒样品中的生物胺种类。

(7)定量分析：采用薄层色谱仪在254nm条件下对色谱板进行扫描，根据样品中斑点对应的的峰面积定量计算黄酒中各生物胺含量及黄酒中生物胺的总量。

所述步骤(3)中有机萃取剂优选异己烷、乙醚、乙酸乙酯等。

所述步骤(3)中加入饱和碱性溶液是让衍生在碱性条件下进行，更利于衍生反应使生物胺带上发光基团并有效降低该检测法的检测限。步骤(3)中加入饱和盐溶液的目的是为了提高灵敏度，促进生物胺进入有机相，使得萃取效率最佳。

所述步骤(5)中的展开剂比例优选展开速度最快、展开时间最短、展开效果最佳的比例。