[发明专利]基于多形汉逊酵母的D-阿拉伯糖醇生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物发酵技术领域，特别涉及一种多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha，H.polymorpha)DL-1发酵生产D-阿拉伯糖醇的方法。

背景技术

D-阿拉伯糖醇(D-arabitol)是一种五碳多元糖醇。其分子式是C₅H₁₂O₅，相对分子量是152.12，熔点为103℃，旋光度为130℃，常温下为白色柱状结晶，易溶于水，不溶于乙醚。多元糖醇是指糖的羰基经过加氢生成的一类多元醇。D-阿拉伯糖醇在医药、食品、化工等领域具有越来越广泛的应用。D-arabitol主要存在于蘑菇类和地衣类生物中，但是含量很低，不能满足日益增长的市场需求。

目前，D-arabitol的生产方法主要是通过化学合成法生产，即将阿拉伯糖在高温高压下催化加氢得到D-阿拉伯糖醇。这种方法需要在高温高压下进行反应，对设备条件要求较高，而且加氢没有选择性，产生的杂质较多，导致后续提取分离工艺繁琐。此外，该方法生产成本高、污染严重。

鉴于化学合成方法存在的缺点，人们将目光逐渐转移到生物发酵法。生物发酵法具有成本较低，易于高密度发酵，节能环保等优点。生物发酵法生产D-阿拉伯糖醇常用的菌株一般都是耐高渗酵母。这主要由于耐高渗酵母在高渗环境中能够代谢产生多元糖醇，实现保护处于高渗条件下生长的细胞的目的。目前用于生产D-阿拉伯糖醇的菌株主要来源于汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(candida)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)和德巴利氏酵母属(Debaryomyces)。

汉逊酵母属中的多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)属于耐热酵母，最高可在49℃条件下生长，易于高密度发酵。值得注意的是，相对较高的培养温度有利于减少大规模发酵培养过程中污染杂菌的可能性。此外，多形汉逊酵母是一种兼性需氧酵母，pH最适范围为2.5～8.0，可以在廉价的非选择性培养基中生长，生产成本较低。因此，多形汉逊酵母是当前国际公认的理想细胞工厂之一，可广泛用于生产高附加值的食品和医药产品。

除个别研究者利用酵母菌对葡萄糖进行转化生产D-阿拉伯糖醇，转化效率可达到50～60％(江宁等，发明专利，CN1286306A)以外，目前现有利用生物发酵法生产D-阿拉伯糖醇的葡萄糖转化率为30～40％，这对生物糖醇工业发展有重要意义。但仍存在无菌要求高、后期分离要求高等缺点，这也限制了生物糖醇的发展。此外，目前的生物转化法未充分利用发酵条件变化对酵母细胞代谢机制的影响以达到提高D-阿拉伯糖醇产量的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于多形汉逊酵母的D-阿拉伯糖醇生产方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案。

将多形汉逊酵母在高渗条件下驯化后进行发酵种子培养得发酵种子培养液，将发酵种子培养液接种至发酵培养基后进行发酵培养，发酵培养的过程为：首先在30～38℃振荡培养18～24h，然后将培养温度升高为40～49℃继续振荡培养18～24h，然后将培养温度降至28～38℃继续振荡培养74～96h，发酵培养过程中摇床转速保持为160～200r/min。

所述多形汉逊酵母的来源为ATCC No.26012。

所述多形汉逊酵母的驯化方法为：将斜面保藏的多形汉逊酵母在37℃活化3～4h后，挑取单菌落接种至5～10mL种子培养基中，然后于37℃、160r/min下振荡培养18～24h得种子液A；将种子液A涂布于高渗固体培养基中，然后于37℃恒温培养24～48h，然后挑取单菌落接种至5～10mL种子培养基中，然后于37℃、160r/min下振荡培养18～24h得种子液B；将种子液B涂布于高渗固体培养基中，然后于37℃恒温培养24～48h，然后挑取单菌落接种至5～10mL种子培养基中，然后于37℃、160r/min下振荡培养18～24h得种子液C；将种子液C涂布于高渗固体培养基中，然后于37℃恒温培养24～48h。

所述发酵种子培养包括以下步骤：取驯化后的多形汉逊酵母单菌落接种到5～10mL种子培养基中，或者将斜面保藏的驯化后多形汉逊酵母在37℃活化3～4h，活化后挑取单菌落接种到5～10mL种子培养基中，接种后于37℃、160～200r/min下振荡培养18～24h。

所述种子培养基的组成包括：酵母膏10g/L，葡萄糖20g/L以及蛋白胨20g/L；种子培养基的pH为6.0。