[发明专利]一种利用双相碳源发酵制备鼠李糖脂的工业化生产方法

权利要求书

1.一种利用双相碳源发酵制备鼠李糖脂的工业化生产方法，其特征在于：该方法的具体步骤如下：

（1）双相碳源优势菌株的选育：将铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CICC10204活化培养，将活化的菌株转接至1#驯化培养基中培养24~60小时，培养温度32~37℃，转速150~200r/min，将培养后的菌液作为移接种子液以3%~5%的接种量接种至已灭菌的2#驯化培养基中培养24~60小时，培养温度32~37℃，转速150~200r/min，再将经2#驯化培养基培养的菌液作为种子液以3%~5%的接种量接种至新配制并灭菌的1#驯化培养基中驯化培养48小时，1#驯化培养基和2#驯化培养基在菌株整个驯化过程是每隔48小时进行交替使用（培养条件相同），并按照上述方法共转接6~10次，驯化培养结束；将驯化后得到的菌液稀释分离，挑出若干支单菌落，进行编号划线培养，并逐一进行发酵培养，筛选出2支产鼠李糖脂性能好、代谢油脂能力和乙醇耐受能力强、遗传性能稳定的菌株转接至保藏斜面（牛肉膏蛋白胨培养基），作为双相碳源优势菌株，4℃保存待用；

（2）菌种的扩大培养：将步骤（1）中得到的双相碳源优势菌株斜面活化培养24~48小时，培养温度32~37℃，然后接种至种子培养基中培养24~36小时，培养温度32~37℃，转速150~200r/min，得到一级种子液；按3~5%的接种量将一级种子液转接到新配制的种子培养基中培养24~36小时，培养温度32~37℃，转速150~200r/min，得到二级种子液；养过程中的通风量（m³/ m³·min）为1：（0.6—1.0）；

（3）发酵培养：将步骤（2）中得到的二级种子液以3~5%接种量接入发酵罐内已灭菌的发酵培养基中，培养温度32~37℃，通风量（m³/ m³·min）为1：（0.6~1.0），搅拌转速150~220r/min，发酵过程pH值控制在 6.3~7.2，培养120~148小时；其中0~30小时植物油用量2%~5%，浓度为20%~50%乙醇用量0.3~0.8%；30小时后，开始流加浓度为20~50%的乙醇，每隔20~24小时流加一次，每次流加量为0.2~1%，直至发酵培养结束；发酵过程中产生的泡沫的控制方法采用喷淋和瞬时压差协同作用法：将发酵罐中的泡沫导入到消泡罐顶部，并通过孔径为1~2mm的泡沫喷淋头喷淋到消泡罐内，同时将高于消泡罐内气压0.1~0.25MPa的无菌空气瞬间释放到消泡罐内，待泡沫消除后停止释放，将泡沫液化后的发酵液用蠕动泵导回发酵罐；

（4）分离提纯：将步骤（3）得到的发酵液通过离心法或膜过滤去除菌体及杂质，再经6K道尔顿超滤膜去除生物大分子和多糖；将收集到的滤液通过蒸发浓缩去除水分，最终获得鼠李糖脂工业化提纯品。

2.根据权利要求1所述的利用双相碳源发酵制备鼠李糖脂的工业化生产方法，其特征在于：所述步骤（1）中的1#驯化培养基的配方为（按质量百分比）：植物油3~6%，浓度为20~50%的乙醇0.1~1%，葡萄糖0.2~0.5%，蛋白胨0.3~0.6%，牛肉膏0.1~0.4%，MgSO₄ 0.02~0.08%，KH₂PO₄ 0.1~0.4%，NaCl 0.03~0.08%，FeSO₄·7H₂O 0.00001~0.00003%，微量元素混合液 0.3~0.8%，余量为水，培养基pH值7.0~7.2；2#驯化培养基的配方为（按质量百分比）：植物油1~3.5%，浓度为20~50%的乙醇1.5 ~5%，葡萄糖0.2~0.5%，蛋白胨0.3~0.6%，牛肉膏0.1~0.4%，MgSO₄ 0.02~0.08%，KH₂PO4 0.1~0.4%，NaCl 0.03~0.08%，FeSO₄·7H₂O 0.00001~0.00003 %，微量元素混合液0.3~0.8%，余量为水，培养基pH值7.0~7.2。