[发明专利]一种用于纤维蛋白和纤维蛋白原及其降解产物的检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物医药领域，具体涉及利用纤维蛋白（原）及其降解产物的含量来检测人体内肿瘤标志物DR-70含量的一种方法及试剂盒。

背景技术

癌症（恶性肿瘤）是威胁我国国民健康的头号杀手，一直是我国医疗卫生防治的重点领域之一。对于癌症防治的主要方法就是进行全民体检，实现早发现、早诊断和及时治疗的目的，提高治愈率。肿瘤标志物是常见的癌症筛查方法，在我国具有非常广泛的应用，但目前常见的肿瘤标志物筛查癌症的准确仅为30-40%，甚至更低。因此，需要开发新的肿瘤标志物和相关的检测/诊断试剂。为了满足肿瘤人群的需求，公司对DR-70（FDP）进行了进一步研究，重新确定了其中与肿瘤密切相关的蛋白片段并建立了相应的检测体系。

美国Donald Ronald医生于1970年在肿瘤病人血液中发现一种环形结构的大分子蛋白，为纪念他的这一发现，该物质用他的姓名首字母及发现年号命名为DR-70。美国AMDL公司于1991年研究证实DR-70是一组与恶性肿瘤密切相关的蛋白质，是肿瘤细胞分泌的一类蛋白水解酶。1992年Justice等人首先证明它为一种肿瘤标志物，并证实DR-70比其它肿瘤标志物如CEA和CA15-3等更加敏感。当恶性肿瘤发生时，人体血液内的DR-70含量就会升高，并异常激活纤溶系统，从而导致纤维蛋白（原）溶解。DR-70免疫测定法可定量检测体内纤维蛋白（原）降解产物（FDP）从而确定体内是否存在癌细胞。

目前，检测人血清中FDP的含量开发的癌症筛查和预后监控的产品已经在美国得到FDA批准，进入临床使用。但是我国尚未大规模开展这个肿瘤标志物的临床应用研究。

国际上的研究认为D、Dimer、E、Y和IPDP等纤维蛋白（原）降解片段是DR-70的直接反应，并开发出针对这些片段的多克隆抗体，用ELISA方法来定量检测血液中FDP的含量，进行癌症筛查。但由于多克隆抗体本身的特性和FDP各降解产物的高级结构等原因，定量检测的结果有一定偏差。

国内针对FDP的定量检测主要是检测D/Dimer降解产物，用胶乳免疫比浊法检测D/Dimer来进行血栓或凝血的检测，未见用于癌症筛查的报道。国外的研究显示，如果只检测D/Dimer进行肿瘤的筛查，会造成临床上50%以上的错误率。

因此，需要建立更加完善的DFP检测技术体系/方法。

发明内容

本文公开了一种检测纤维蛋白和纤维蛋白原及其降解产物的方法和应用，其包括对纤维蛋白、纤维蛋白原、纤维蛋白（原）降解中间体X片段、纤维蛋白（原）降解中间体Y片段、纤维蛋白（原）降解产物D片段和纤维蛋白（原）降解产物D-二聚体，总计六种纤维蛋白和纤维蛋白原及其降解混合物的同步检测。方法包括用特异性多克隆抗体和单克隆抗体对上述六种混合物进行同时检测，其中所述的多克隆抗体和单克隆抗体均是特异性的。

为实现上述发明目的，技术方案包括以下步骤。

制备和纤维蛋白（原），纤维蛋白（原）降解中间体X、Y片段和降解产物D、D-dimer等蛋白/多肽片段结合的多克隆抗体和单克隆抗体：

（1）    利用大肠杆菌表达纤维蛋白（原）及其降解产物D、D-dimer及中间体X、Y等蛋白或蛋白片段；

（2）    利用层析柱、蛋白凝胶、反相柱等方法将表达的蛋白纯化，冻干，形成冻干粉；

（3）    将冻干粉作为抗原，免疫新西兰大白兔，制备并筛选多克隆抗体；

（4）    将冻干粉作为抗原，免疫Balb/c小鼠，制备并筛选单克隆抗体。

建立ELISA检测体系。

以[0010]中制备的多克隆抗体为包被抗体，用来包被酶标板并与检测样本中的检测目标结合，将其固定在酶标板上。以[0010]中制备的单克隆抗体为捕捉抗体，与固定在酶标板上的检测目标结合，形成多克隆抗体-检测目标-单克隆抗体复合物，以购自HRP标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）作为酶标抗体，检测复合物中的单克隆抗体，建立ELISA检测体系。

确定ELISA体系的线性范围。

确定上述的单抗比例后，根据常见的ELISA检测流程，确定本发明方法的现行检测范围：将标准品做成不同的检测梯度（0、12.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml、800ng/ml）。检测结果显示：该方法在12.5ng/mL-400 ng/mL的含量范围内，该方法呈线性关系，线性相关系数R>0.990。