[发明专利]一种青稞成熟胚愈伤组织的诱导培养基及其培养方法

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种青稞成熟胚愈伤组织的诱导培养基及其培养方法。

背景技术

青稞(Hordeum vulgare L.var.nudum Hook.f.)属禾本科大麦属，因其内外稃与颖果分离，籽粒裸露，故称裸大麦，属大麦变种，是青藏高原最具特色的农作物(吴昆仑,赵媛等，2012)。传统常规育种存在着周期长、改良进程缓慢等缺点，利用转基因手段将特定的外源基因导入青稞中，从而定向改良青稞品种，为青稞遗传育种提供了一条新途径。然而建立便携、高效和稳定的组织培养体系是限制其转基因技术发展的一个最主要因素(陶丽莉等.2008)。成熟胚存在取材方便，不受季节限制，一次收获可大量持续稳定供应等优点，因此成为目前研究者进行突破的热点。

目前为止，青稞组织培养方面的研究较少。而在大麦组织培养方面的研究表明，以成熟胚为外植体时，其大麦生根长芽现象明显，从而限制了成熟胚组织培养的发展(Han et al,2011；蓝庆等,2012)。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种青稞成熟胚愈伤组织的诱导培养基及其培养方法，用于诱导获得青稞成熟胚的愈伤组织。本发明方法可以明显抑制青稞成熟胚愈伤诱导过程中的生根长芽现象，能够获得质量较好的青稞愈伤组织。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

一种青稞成熟胚愈伤组织的诱导培养基，该青稞成熟胚诱导培养基以MS培养基为基础，添加麦芽糖和2,4-二氯苯氧乙酸，麦芽糖浓度为30g/L，2,4-二氯苯氧乙酸浓度为6-10mg/L为培养液，调节pH为5.8-6.0；然后加入琼脂或植物凝胶固化，琼脂或植物凝胶与培养液的重量比＝0.55％或0.35％；最后在1.1个大气压、121℃条件下灭菌20min，得到。

进一步的，利用所述培养基进行青稞成熟胚愈伤组织诱导的方法为：挑选饱满的青稞种子，用蒸馏水清洗后，用75％酒精浸泡2-3min，用蒸馏水清洗2-3次；用5％次氯酸钠溶液浸泡15min，蒸馏水清洗3-5次；无菌蒸馏水浸泡18-24h；用5％次氯酸钠溶液浸泡10min，无菌蒸馏水清洗3-5次；用解剖针挑取青稞成熟胚，并将其刮碎后接种于上述培养基上，于23-25°暗培养10-15d，得到青稞成熟胚初代愈伤组织。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明提供的抑制发芽/生根的青稞成熟胚诱导培养基中碳源为麦芽糖，与传统培养基中常用的蔗糖和葡萄糖相比，可以使培养基保持较高的渗透压，提高青稞成熟胚的愈伤组织。同时本发明比较了2-10mg/L2,4-二氯苯氧乙酸的添加对青稞出愈率的影响，发现10mg/L的浓度可以有效抑制青稞发芽/生根。传统的表面消毒采用较高浓度次氯酸钠(15-50％)处理30min，本发明中仅用5％次氯酸钠消毒10-15min，即可有效控制污染，同时由于降低次氯酸钠溶液、缩短处理时间从而减小次氯酸钠对成熟胚的损伤，从而提高出愈率。

附图说明

图1为使用葡萄糖，蔗糖，麦芽糖为碳源的青稞成熟胚愈伤组织出愈率。

图2为不同2,4-二氯苯氧乙酸浓度所得青稞愈伤组织生长图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明方案做进一步详细描述：

一种青稞成熟胚愈伤组织的诱导培养基，该青稞成熟胚诱导培养基以MS培养基为基础，添加麦芽糖和2,4-二氯苯氧乙酸，麦芽糖浓度为30g/L，2,4-二氯苯氧乙酸浓度为6-10mg/L为培养液，调节pH为7.8；然后加入琼脂或植物凝胶固化，琼脂或植物凝胶与培养液的重量比＝0.55％或0.35％；最后在1.1个大气压、121℃条件下灭菌20min，得到。

进一步的，利用所述培养基进行青稞成熟胚愈伤组织诱导的方法为：挑选饱满的青稞种子，用蒸馏水清洗后，用75％酒精浸泡2-3min，用蒸馏水清洗2-3次；用5％次氯酸钠溶液浸泡15min，蒸馏水清洗3-5次；无菌蒸馏水浸泡18-24h；用5％次氯酸钠溶液浸泡10min，无菌蒸馏水清洗3-5次；用解剖针挑取青稞成熟胚，并将其刮碎后接种于上述培养基上，于23-25°暗培养10-15d，得到青稞成熟胚初代愈伤组织。

试验例1：

以MS培养基为基础培养基，添加2mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，分别以蔗糖、葡萄糖和麦芽糖为碳源为青稞成熟胚愈伤诱导培养基，结果表明以麦芽糖为碳源时，青稞成熟胚的出愈率明显高于葡萄糖和蔗糖为碳源时的出愈率(如图1所示)。

试验例2：