[发明专利]恶性疟原虫纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒及核苷酸序列

权利要求书

1.一种恶性疟原虫纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如下组分：纳米磁微粒、标本稀释液、裂解液、结合液、洗液、洗脱液、实时荧光PCR反应液、质粒标准品、阳性对照、阴性对照；

所述的纳米磁微粒为用无水乙醇配制的纳米磁微粒溶液；

所述标本稀释液为磷酸盐缓冲液PBS；

所述裂解液为5M异硫氰酸胍溶液；

所述结合液为无水乙醇；

所述洗液为70％乙醇；

所述洗脱液为TEpH8.0；

所述实时荧光PCR反应液包括上游引物F1，见序列1，下游引物R1，见序列2和荧光探针P1，见序列3；

所述的质粒标准品为含有恶性疟原虫基因片段(S)的质粒；

所述的阳性对照为恶性疟原虫质粒标准品；

所述的阴性对照为正常人全血核酸提取液。

2.根据权利要求1所述的恶性疟原虫纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：疟疾疑似病例全血标本通常有两种形式，一种是抗凝全血标本，包括静脉全血和末梢全血，末梢包括耳垂、中指、无名指或食指，抗凝剂采用EDTA钠盐或钾盐或枸橼酸钠，置于2-8℃或-20℃保存，供核酸提取用；一种是滤纸干血片标本，取疑似病例末梢血滴于灭菌的滤纸上，室温晾干后放入塑料袋密封，置于常温18-25℃或2-8℃或-20C保存，供核酸提取用。

3.根据权利要求1所述的恶性疟原虫纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述Fe₃O₄纳米磁微粒分离提取全血标本和滤纸干血片标本中恶性疟原虫DNA的步骤分述如下：

所述纳米磁微粒MNP分离提取全血标本中恶性疟原虫DNA的步骤为：

⑴在1.5mL离心管中加入裂解液150μL，加入恶性疟疑似病人全血标本50μL，标本量不足50μL时，用标本稀释液补足，涡旋或颠倒混匀，56℃10min；

⑵加入200μL结合液，加入20μLMNP,25μg/μL，涡旋或颠倒混匀，室温静置10min，用磁铁吸附MNP，弃上清；

⑶加入300μL洗液清洗MNP，用磁铁吸附MNP，弃上清；重复清洗一次；2000rpm，短暂离心，用吸头吸走残液；

⑷加入50μL洗脱液，将MNP吹打混匀，56℃5min，取出后立即用磁铁吸附MNP，吸取上清液备用。

4.根据权利要求3所述的恶性疟原虫纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述纳米磁微粒MNP分离提取全血滤纸干血片标本中恶性疟原虫DNA的步骤为：

⑴将自然晾干的全血滤纸干血片标本，约1cm²大小，血量约为15-30μL，剪成纸条，放入1.5mL离心管中，向其中加入100μL的标本稀释液，加入裂解液150μL，涡旋或颠倒混匀，56℃10min；8000rpm离心1min，吸取上清液于另一支1.5mL离心管中；

(2)在上述装有上清液的离心管中，加入200μL结合液，加入20μLMNP,25μg/μL，涡旋或颠倒混匀，室温静置10min，用磁铁吸附MNP，弃上清；

⑶加入300μL洗液清洗MNP，用磁铁吸附MNP，弃上清；重复清洗一次；2000rpm，短暂离心，用吸头吸走残液；

⑷加入50μL洗脱液，将MNP吹打混匀，56℃5min，取出后立即用磁铁吸附MNP，吸取上清液备用。

5.一组恶性疟原虫实时荧光定量PCR检测用核苷酸序列，其特征在于：其核苷酸序列为序列1、序列2、序列3，其中序列1为上游引物、序列2为下游引物、序列3为荧光探针。

6.根据权利要求5所述的一组恶性疟原虫实时荧光定量PCR检测用核苷酸序列，其特征在于：所述上游引物、下游引物、荧光探针的浓度为：上游引物200nM，下游引物200nM，荧光探针120nM。