[发明专利]一种同时靶标番木瓜病毒PRSV和PLDMV的嵌合基因、植物表达载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种同时靶标番木瓜病毒PRSV和PLDMV的嵌合基因及植物表达载体。通过对GenBank 中的两种病毒（番木瓜环斑病毒(PRSV)和番木瓜畸形花叶病毒（PLDMV））的多条基因组全长序列进行比对，筛选到两种病毒在基因组范围内的共同保守区域；最终选定各病毒序列，人工合成621 bp的嵌合基因。以该嵌合基因为模板，用高保真Taq酶进行PCR反应获得不同长度的正反向序列，提供不需要另外插入内含子，同时靶标PRSV、PLDMV的NIb和Hc-Pro基因的RNAi植物表达载体构建方法。该载体可用于基因枪或农杆菌介导的遗传转化，获得高效、广谱同时抗PRSV和PLDMV病毒病的新种质。

背景技术

番木瓜（Carica papaya L.）与香蕉、菠萝并称为热带三大草本果树，是人们喜爱的果蔬兼药用的热带水果，在我国南方享有“万寿果”和“岭南佳果”的美誉。目前在番木瓜生产中遇到了实际性迫切需要解决的问题:番木瓜环斑病毒引起的毁灭性严重病害威胁着世界番木瓜生产国之种植业和加工产业的发展，它能导致当年种植的木瓜全部发病，产量、酶含量严重下降，使番木瓜由多年生变为一年生，这一因素大大限制了番木瓜的生产和利用。并且有报道抗PRSV的转基因番木瓜能被PLDMV侵染，说明PLDMV在台湾和其他地区有可能威胁着目前转基因番木瓜的推广和应用。由于目前在栽培技术上还很难通过化学防治的方法予以防治PRSV和PLDMV，因此种植抗病品种是防治病毒病害的经济而有效的措施。然而由于番木瓜株性复杂（有雄性株、雌性株和两性株），并且番木瓜是异花授粉果树，即使通过杂交手段成功选育抗耐病品种，其后代的性状必然严重分离，很难保持其抗病优良性状不变。因此，通过转基因技术培育出稳定、高抗、谱抗，且安全性好的新品种是发展番木瓜生产的当务之急，是防治番木瓜病毒病的根本途径。

Fitch等（1990）首次将PRSV外壳蛋白CP基因转入到番木瓜中并成功获得了稳定遗传的转化植株，这也是首例商业化的转基因水果。国内，叶长明等首次克隆了PRSV华南优势株系Ys的CP基因，并转化了番木瓜。周鹏等也利用农杆菌转化法获得了转CP基因的植株。台湾Yeh研究组通过将PRSV和PLDMV的CP基因构成融合基因，获得抗PRSV和PLDMV的转基因番木瓜。由于PRSV在各地区的病毒株系的CP基因存在很大差异，这些转基因植株仅对病毒基因同源性高的病毒株系有抗性，而对同源性较底的株系没有抗性，造成一个地区的转基因植物在另一地区种植表现出的抗病能力减弱甚至抗性丧失，并且抗病效果还与基因的表达量相关。CP基因介导的抗病性主要表现在病毒侵染的早期，表现在只是延迟发病，当存在高接种量或重复接种时则会破坏其抗性。此外，还有一个非常重要的问题是PRSV田间发病生态复杂，不同株系间复合感染的比例可达44.08%，也给番木瓜的抗PRSV育种造成了非常大的困难。另外利用CP基因介导的抗病性具有潜在的危险性，如外壳蛋白对其它病毒的包壳作用可能会导致非蚜传病毒变为蚜传病毒。因此，人们担心导入植物的CP基因的mRNA可能与病毒基因重组导致新病毒的产生。Nib基因介导的抗性在番木瓜抗病毒病的研究中取得了一定成功。与CP基因介导的抗性相比，Nib基因介导的抗性有以下特点：抗性强，能使转基因植株产生免疫或高抗；持续时间长；但作用范围相对狭窄，只对Nib基因来源的亲本株系有抗性，而对那些与亲本株系有一定差别的同种不同株病毒不表现抗性；许多转基因植株表现起初感染而后康复的可诱导抗性。

RNA沉默是真核生物中普遍存在，发生在转录或转录后水平的基因沉默现象。双链RNA(dsRNA)或带部分双链的发夹结构(hpRNA)被切割加工成小的干扰RNA（siRNA）, siRNA利用碱基互补的原则指导RNA沉默诱导复合物（RISC）的Argnaute蛋白降解同源RNA或抑制它们的翻译或者修饰同源DNA，从而抑制它们的表达。由于不需要产生新的蛋白，因此应用RNA沉默技术在育种中具有高效特异和安全等特点。RNA沉默技术的应用，为我们提供了一条更为有效、安全的抗病毒新策略。由于反向重复序列转入植物后，可以通过转录产生互补的双链RNA或发夹结构RNA，有效引发转基因植物中的RNA沉默；并且反向重复序列片段小，有利于构建含多个病毒基因的嵌合基因，获得同时抗多种病毒的转基因植株，因此已经成为最有效的抗病毒策略之一。目前利用RNA沉默技术已经成功获得高抗、稳定、且安全性高的抗病毒转基因大豆、西红柿、马铃薯等作物。因此利用RNAi技术培育同时抗PRSV和PLDMV番木瓜新品系，在理论上是可行的。