[发明专利]一种嗜热碱性重组含锰过氧化氢酶及其毕赤酵母表达载体和工程菌

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种嗜热碱性重组含锰过氧化氢酶及其毕赤酵母表达载体和工程菌。

背景技术

过氧化氢酶（Catalase，简称CAT），催化分解过氧化氢为水和氧气。CAT广泛应用于食品、纺织、造纸和医药等行业，其中在纺织工业中主要用于布料漂白后残余H₂O₂的消除。与传统工艺的水洗或化学助剂相比，CAT具有减少污染、提高后续印染质量等优点；但值得关注的是，印染工序通常是在高温（T>70℃）碱性（pH>9）环境中进行的，这就需要CAT具备嗜热嗜碱的应用特性。尽管CAT来源丰富，几乎存在于所有的需氧微生物中，但市场上目前仍缺乏具备优良纺织应用特性的CAT。

过氧化氢酶按催化中心结构差异可分为两类：（1）含铁卟啉环结构CAT，又称铁过氧化氢酶（FeCAT）；（2）由锰离子代替铁离子的卟啉结构，又称锰过氧化氢酶（MnCAT），目前已发现约280种FeCAT和30种MnCAT。近年来，研究者发现个别来源于高温碱性环境中的古细菌可以产生具有嗜热嗜碱特性的MnCAT，例如：Metallosphaera hakonensis来源的MnCAT，在pH8.0-10.0环境中处理60min酶活损失小于20%；在70℃下处理50min，酶活残留率约在60%(Alkali-tolerant high-activity catalase from a thermophilic bacterium and its overexpression in Escherichia coli,Protein expression and purification,2008.57(2):255-260.)。但目前这类嗜热MnCAT的研究仍处于初级阶段，国外文献报道的该类MnCAT最高发酵酶活力仅约为20U/ml，国内也鲜有报道。大肠杆菌和毕赤酵母表达系统是目前工业生产中最为成熟的基因工程表达系统，目前关于该酶在毕赤酵母中的表达的文献还未见报道。

发明内容

本发明鉴于上述情况，根据毕赤酵母密码子使用偏爱性，对Thermus thermophilus HB27来源的锰过氧化氢酶基因序列进行密码子优化，提供一种嗜热碱性重组含锰过氧化氢酶及其毕赤酵母表达载体和工程菌，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种重组含锰过氧化氢酶的多核苷酸，其序列如SEQ ID No：1所示。

所述多核苷酸序列根据Thermus thermophilus来源的锰过氧化氢酶基因核苷酸序列，按照毕赤酵母（Pichia pastoris）密码子使用偏爱性（http://gcua.schoedl.de/seqoverall_v2.html）优化设计。

本发明第二方面提供一种重组含锰过氧化氢酶，由所述的多核苷酸序列编码。

本发明第三方面提供一种重组含锰过氧化氢酶表达载体（pPIC3.5K-MnCAT），包含所述重组含锰过氧化氢酶的多核苷酸序列。

优选的，所述表达载体为pPIC系列表达载体。

更优选的，所述pPIC系列表达载体为pPIC3.5K。所述pPIC3.5K购自Invitrogen公司。

本发明第四方面提供一种工程菌（KM71/pPIC3.5K-MnCAT），所述工程菌由所述重组含锰过氧化氢酶表达载体（pPIC3.5K-MnCAT）转化获得。

优选的，所述工程菌由所述重组含锰过氧化氢酶表达载体转化毕赤酵母获得。

更优选的，所述毕赤酵母为毕赤酵母KM71。

本发明第五方面提供所述重组含锰过氧化氢酶的制备方法，包括如下步骤：

将所述工程菌在种子培养基中活化后，转接至发酵培养基中培养，当菌浓OD600达到100-120时，添加MnCl₂，同时添加甲醇并进行诱导培养。

所得培养液的菌体破碎上清液中CAT酶活力可达12000U/ml。

本领域技术人员可根据经验，选择适合的蛋白纯化技术对所得培养液的具体破碎上清液进行处理，以期获得目标重组含锰过氧化氢酶。

优选的，所得培养液的菌体破碎上清液可依次通过常规蛋白纯化方法中的疏水层析、阴离子交换和凝胶过滤等步骤进行蛋白纯化。

优选的，所述种子培养基中活化的具体方法为：YPD培养基中，于30℃下200rpm/min培养19-22h。