[发明专利]利用酵母细胞制备登革病毒样颗粒及其在疫苗中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体地，涉及利用酵母细胞制备登革病毒样颗粒及其在疫苗中的应用，更具体地，涉及酵母细胞、制备登革病毒样颗粒的方法、登革病毒样颗粒及疫苗。

背景技术

登革热是由登革病毒（Dengue virus,DEN）引起的急性传染病，以传播迅速，发病率高为主要特征，临床上表现为登革热（dengue fever,DF）和登革出血热/登革休克综合症（dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome,DHF/DSS），登革出血热/登革休克综合症(DHF/DSS)以高热、严重出血、休克和高病死率为主要临床表现。登革热广泛流行于全球热带及亚热带，包括亚洲、大洋州、美洲及非洲的100多个国家和地区，以东南亚和西太平洋地区的流行最为严重。近年来，由于全球气候变暖和国际人口大量流动等原因，目前，登革热已成为世界上分布最广、发病最多的虫媒病毒病。

登革病毒疫苗的研究已有70多年的历史，但迄今尚无有效的疫苗问世。究其原因，主要是与登革病毒的致病机制有关，特别是与登革出血热/登革休克综合症(DHF/DSS)的发病机制与抗体介导的免疫增强作用有关，即初次感染后产生的亚中和浓度的抗体或非中和抗体在二次感染时不仅没有免疫保护作用，反而会增强病毒的感染，引起严重的临床过程。因此认为，研发针对登革病毒四个血清型的多价疫苗，同时预防不同血清型登革病毒的感染，可能是研发登革病毒疫苗唯一有效的途径。人们进行着各种尝试，仅重组技术就有利用大肠杆菌、毕赤酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞等各种系统，虽然也有获得病毒样颗粒的成功记录，例如，1997年新加坡国立大学研究小组曾报道用单细胞的毕赤酵母菌表达登革病毒样颗粒的研究，他们采用Pichia酵母系统表达登革热2型的病毒样颗粒，但需要甲醇诱导，无法取得大规模生产大量登革热2型的病毒样颗粒。中国也在做这方面的研究，但也未见到真正稳定高效的生产出理想的疫苗。

因而，制备登革病毒样颗粒的方法仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种无需甲醇诱导，可准确表达病毒结构蛋白（prM、E）、可工业化生产的制备登革病毒样颗粒的手段。

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

登革病毒的核酸（结构示意图见图1）是单链的RNA，具有单一的可读框架，可翻译产生核蛋白（C）、膜蛋白前体（prM）、壳蛋白（E）等3种病毒的结构蛋白，和7种病毒的非结构蛋白（NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b，NS5）。其中登革病毒的颗粒是由C、prM、E所组成，而构成病毒颗粒的外壳则是由prM和E所组成。其中，E蛋白是引起病毒中和抗体的抗原，而中和抗体是阻断病毒感染的体液免疫的主要抗体。因此，E蛋白是登革病毒疫苗的主要和不可缺少的组分；prM是病毒的膜蛋白前体，它在E蛋白的成熟表达和构象方面发挥至关重要的作用；而病毒核蛋白C主要分布在病毒颗粒内部，一般认为，C与病毒的免疫以及与病毒prM、E的构象和功能无直接关系。酵母是真核细胞的表达系统。酵母细胞已经成功地表达和生产了包括乙肝疫苗在内的大量不同的生物活性物质。在登革病毒疫苗研究领域，1997年新加坡国立大学曾用单细胞的毕赤酵母表达了登革病毒2型所有的结构蛋白C、prM和E，并构建了病毒样颗粒。但是，由于毕赤酵母的生长需要甲醇诱导，增大了工业化生产中无菌操作的难度，使得这个系统在生产上有很多限制。

鉴于上述发现，根据登革病毒和酵母细胞的特点，发明人利用面包/啤酒酵母强有力的启动子、自我装配病毒颗粒的特殊功能和一定的表达后的修饰功能，表达和制备仅包含prM和E两种病毒结构蛋白的病毒样颗粒疫苗的独特设计。并构建了登革II型病毒样颗粒的重组质粒，成功地试表达了II型的登革病毒样颗粒。这是国际上首次使用酵母细胞表达仅有prM和E两个病毒结构基因的登革病毒样颗粒。

具体而言，在本发明的一个方面，本发明提供了一种酵母细胞。根据本发明的实施例，所述酵母细胞表达第一蛋白质和第二蛋白，其中，所述第一蛋白质具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；以及所述第二蛋白质具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。发明人发现，本发明的酵母细胞能够有效表达仅含登革病毒的膜蛋白前体（prM）和壳蛋白（E）两个病毒结构蛋白的登革病毒样颗粒，且获得的登革病毒样颗粒只具备免疫原性，不具备感染原性，能够有效用于制备登革病毒疫苗。