[发明专利]窖泥中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌、甲烷菌的定量分析方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及窖泥中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌、甲烷菌的定量分析方法。

背景技术

窖池是白酒生产过程中，集糖化、酒化、酯化等多种反应于一体的酿酒容器。俗话说“老窖出好酒”，在白酒生产实践中，往往发现靠近窖底、窖壁的糟醅，其酒浓郁芳香，其根本原因在于窖泥中与生香有关的功能菌群的代谢作用。窖池本身就是多种微生物的载体，随着发酵长期连续的进行，窖泥中的功能微生物不断地得到驯化和富集，最终形成其特有的微生物群落。因此，窖泥中微生物群落的种类和数量对白酒风味物质的形成有着重要的影响。研究者采用传统培养以及现代分子生物学技术等方法，对窖泥中微生物群落结构进行分析和研究，发现梭菌（Clostridium）、乳酸菌（Lactobacillus）、芽孢杆菌（Bacillus）、甲烷菌（Methanobacterium）等是窖泥中的主要功能微生物菌群，但窖泥中功能微生物多数为厌氧微生物，且不易纯培养，不能准确对窖泥中的功能微生物进行的检测。因此，阐明窖泥中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌、甲烷菌等功能微生物的生物量的变化情况，对人工窖泥的开发、窖泥的质量控制以及白酒风味物质的形成都具有重要的意义。

目前对窖泥中微生物定量检测仍然采用选择培养基的筛选和纯培养分离计数的方法，易受到外界环境因素，菌种特性等影响，检测结果缺乏稳定性和可靠性，且耗时费力。荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术不仅实现了DNA模板的定量，而且具有特异性强、灵敏度高、高通量、反应全封闭、定量准确、速度快及自动化程度高等优点，已成为分子生物学及微生物领域中重要的定量方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为分析窖泥中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌、甲烷菌提供一种新选择。

本发明的技术方案是窖泥中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌、甲烷菌的定量分析方法，包括如下步骤：

a、标准曲线的制备：设计针对梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌和甲烷菌的标准细菌的特异性引物，然后进行荧光定量PCR，根据拷贝数与CT值构建的标准曲线；

b、提取基因组DNA：利用洗脱、酶消化结合的方法提取窖泥微生物群落的宏基因组；

c、扩增：采用梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌和甲烷菌的特异性引物，对窖泥微生物宏基因组中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌和甲烷菌的特异性片段进行扩增；

d、定量分析：通过标准曲线和待测样品的CT值对窖泥微生物群落中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌和甲烷菌进行定量分析。

具体的，步骤a和c中扩增梭菌的特异性引物如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

具体的，步骤a和c中扩增乳酸菌的特异性引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

具体的，步骤a和c中扩增芽孢杆菌的特异性引物如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

具体的，步骤a和c中扩增甲烷菌的特异性引物如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。

梭菌特异性引物序列（5′→3′）：

Clost-F：AAAGGRAGATTAATACCGCATAA（SEQ ID No.1）；

Clost-R：TTCTTCCTAATCTCTACGCA（SEQ ID No.2）。

乳酸菌特异性引物序列（5′→3′）：

Lacto-F：AGAACACCAGTGGCGAAGG（SEQ ID No.3）；

Lacto-R：CAGGCGGAGTGCTTAATGC（SEQ ID No.4）。

芽孢杆菌特异性引物序列（5′→3′）：

Bacil-F：ATGGCTGTCGTCAGCT（SEQ ID No.5）；

Bacil-R：ACGGGCGGTGTGTAC（SEQ ID No.6）。

甲烷菌特异性引物序列（5′→3′）：

Metha-F：GGTGGTGTMGGATTCACACARTAYGCWACAGC（SEQ ID No.7）；

Metha-R：TTCATTGCRTAGTTWGGRTAGTT（SEQ ID No.8）。

上述引物中的R为A或G；W为A或T；M为A或C；Y为T或C。