[发明专利]黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子标记及其专用引物和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域的分子标记，特别涉及与黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4连锁的分子标记及其在黄瓜种质资源选择中的应用。

背景技术

黄瓜(Cucumis Sativus.L)在世界上广泛栽培，中国是世界上黄瓜栽培面积最大、总产量最高的国家。

黄瓜枯萎病（Fusarium Wilt），又名萎蔫病、蔓割病、死秧病，由尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum Owen.)侵染所致，是一种由土壤传染，从根或根颈部侵入，在维管束内寄生的系统性病害（导管型枯萎病），是黄瓜生产上较难防治的三大病害之一，是目前世界各地黄瓜，特别是温室和其他保护地黄瓜的主要土传病害，一般年份可使黄瓜产量损失25%-35%，严重发病时可使黄瓜绝产。枯萎病采用化学防治效果不理想，不仅使生产投入增加且会造成环境安全隐患，倒茬嫁接虽常用于防控但增添技术困难和劳动成本。因此选育抗病品种是解决枯萎病危害的最佳途径。

黄瓜枯萎病抗病基因影响黄瓜对枯萎病的抗性，它的研究将会推动抗病育种进程。用与目的性状紧密连锁的分子标记进行标记辅助选择在黄瓜遗传育种中十分有效，分子标记是在DNA水平上对目标性状进行选择，具有高效、快速、不受环境条件限制等优点，可在苗期进行选择，加快育种进程。因此，开发用于辅助鉴定黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子标记十分必要。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子标记及其专用引物和应用。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子标记，是用以下引物自黄瓜总DNA中扩增出来的核苷酸序列之一：序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

获得上述黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子标记的引物如下：1）获得黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子标记FWSNP1的引物为序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；2）获得黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子标记FWSNP2的引物为序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

利用上述引物对，通过常规PCR法可得到上述分子标记。

本发明涉及的与黄瓜抗枯萎病共分离的dCAPs标记FWSNP1，是利用抗/感遗传群体（母本：WF2757，抗枯萎病；父本：津研二号，感枯萎病）进行精细定位和克隆获得的。通过利用90个RIL-F₈株系，130株的F_2:3群体对枯萎病抗病基因Foc-4进行初步定位，然后利用2000株的F₂群体对Foc-4进行精细定位到25kb的区间内。该区间内含2个基因，分别是TIR NB-ARC抗病基因和bHLH96-like转录因子，其中TIR NB-ARC基因经过验证分析，被证实为枯萎病抗病基因Foc-4的重要候选基因。通过对比研究Foc-4基因在抗/感黄瓜材料中的序列差异，发现一个SNP位点，依据http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html，在线设计软件，开发设计了与抗/感枯萎病紧密连锁的dCAPs分子标记FWSNP1。同时利用FWSNP1标记分析2000多株遗传群体材料，结合田间枯萎病接种鉴定研究，发现FWSNP1标记与抗感枯萎病紧密连锁，达到共分离。

本发明涉及的另一个黄瓜抗枯萎病SNP2关键位点，其在抗病基因Foc-4中导致了氨基酸编码的变化。该SNP位点是通过对不同遗传背景的黄瓜枯萎病抗感材料进行基因组重测序获得的，通过对多个黄瓜抗感材料进行重测序，利用BWA-Samtools(v0.1.12a，mpileup按照默认参数)软件分析Foc-4基因在不同材料中的SNP位点，结合黄瓜基因组9930-V2和基因组注释，发现Foc-4基因的915位存在单碱基差异SNP2位点（由A到C），导致了Foc-4基因中编码氨基酸的差异（从Ile到Leu）。并利用该SNP2位点设计标记，获得FWSNP2分子标记，通过分析上述黄瓜材料的基因型，结合田间枯萎病接种鉴定材料抗感病表型，发现FWSNP2标记分析的基因型与抗感表型一致，证明FWSNP2可作为枯萎病紧密连锁分子标记，筛选黄瓜材料。

上述分子标记或引物在选育抗黄瓜枯萎病品种中的应用。