[发明专利]生产成熟的人促红细胞生成素的方法以及包含获自该方法的人促红细胞生成素的组合物

权利要求书

1.一种在巴斯德毕赤氏酵母中生产成熟的人促红细胞生成素的方法，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸封端的双分枝N-聚糖，并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性，所述方法包括：

（a） 提供重组巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其被遗传工程化以生产唾液酸封端的双分枝N-聚糖，并且不展现对于N-聚糖或O-聚糖的β-甘露糖基转移酶2活性，并且不展现选自对于N-聚糖或O-聚糖的β-甘露糖基转移酶1活性和β-甘露糖基转移酶3活性的至少一种活性，并且其包括两种或更多种核酸分子，各自编码包含融合到信号肽的成熟的人促红细胞生成素的融合蛋白，所述信号肽靶向ER并且当所述融合蛋白处于ER中时被除去；

（b） 在对表达和加工所述第一和第二融合蛋白有效的条件下在培养基中生长所述宿主细胞；以及

（c） 从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素，来产生所述成熟的人促红细胞生成素，其主要包含唾液酸封端的双分枝N-聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。

2.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞不展现对于N-聚糖或O-聚糖的β-甘露糖基转移酶2活性、β-甘露糖基转移酶1活性和β-甘露糖基转移酶3活性。

3.权利要求2的方法，其中所述宿主细胞进一步不展现对于N-聚糖或O-聚糖的β-甘露糖基转移酶4活性。

4.权利要求1的方法，其中所述信号肽是酿酒酵母αMATpre信号肽或鸡溶菌酶信号肽。

5.权利要求1的方法，其中至少一种核酸分子编码下述融合蛋白，其中促红细胞生成素融合到酿酒酵母αMATpre信号肽，并且至少一种核酸分子编码下述融合蛋白，其中促红细胞生成素融合到酿酒酵母αMATpre信号肽鸡溶菌酶信号肽。

6.权利要求1的方法，其中编码促红细胞生成素的核酸分子的核酸序列的密码子为了在巴斯德毕赤氏酵母中表达而被优化。

7.权利要求1的方法，其中与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性在夹心ELISA中测定。

8.权利要求1的方法，其中与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性在Western印迹中测定。

9.权利要求1的方法，其中从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素包括阳离子交换层析步骤，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸封端的双分枝N-聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。

10.权利要求1的方法，其中从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素包括羟磷灰石层析步骤，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸封端的双分枝N-聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。

11.权利要求1的方法，其中从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素包括阴离子交换层析步骤，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸封端的双分枝N-聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。

12.一种包含获自权利要求8的方法的成熟的人促红细胞生成素和药学上可接受的盐的组合物，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸封端的双分枝N-聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。

13.权利要求12的组合物，其中所述成熟的人促红细胞生成素共轭到亲水性聚合物，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸封端的双分枝N-聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。

14.权利要求13的组合物，其中所述亲水性聚合物是聚乙二醇聚合物。