[发明专利]靶向转染肽核酸的超声微泡及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因超声靶向转染领域，具体涉及一种靶向转染肽核酸的超声微泡及其制备方法和应用。

背景技术

C-myc原癌基因是myc基因家族的重要成员之一，是多种生长因子刺激后诱导的即刻早期基因。它既是一种可易位基因，又是一种多种物质调节的可调节基因。C-Myc在胞浆内合成后，与其它蛋白形成寡聚体，再转移到核内，并结合到特异性的DNA序列上，从而激活和抑制许多靶基因的转录，引起细胞生长和分化的改变，发挥其生理调节功能及恶性转化作用。是一种可使细胞无限增殖，获永生化功能，促进细胞分裂的基因。myc基因参予细胞凋零、多种肿瘤发生发展、血管损伤后内膜平滑肌细胞早期诱导、分化、增殖和迁移以及内膜细胞间基质的合成与堆积调节。

反义寡核苷酸靶向抑制肿瘤、平滑肌细胞增生相关癌基因的体外研究已取得极大的进展，作为基因药物应用于体内受限主要是它极易被核酸酶降解使其半衰期极短；进入特定的靶细胞较难且较少。因此，许多学者希望通过对其进行化学修饰增加其抵抗核酸酶的能力；用病毒携带增加其转染特异性等。但丹麦哥本哈根大学的Nielsen等设计合成的肽核酸（PNA）是已知DNA或RNA最成功的类似物。

PNA是一类人工合成的DNA或RNA类似分子，与核酸分子不同之处是将DNA或RNA分子中的磷酸脱氧核糖核酸或磷酸核糖骨架由重复排列的有酰胺键连接的N-2-乙基甘氨酸单位（肽链）取代。PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。由于PNA不带负电荷，与DNA和RNA之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；不同于DNA或DNA、RNA间的杂交，PNA与DNA或RNA的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响，与DNA或RNA分子的杂交能力远优于DNA/DNA或DNA/RNA，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解，并可以与配基相连共转染进入细胞，其细胞毒性较低。这些都是其他寡核苷酸所不具备的优点。可作为基因探针，并能以反义序列的形式用于基因功能、基因表达调控等研究。

在药用研究方面，目前，它是在第一代、第二代反义试剂的基础上，通过计算机设计构建并最终人工合成的第三代反义试剂。根据PNA的代谢稳定性，主要将其用于抑制基因表达的反义药物研究领域，国外几家制药及生物技术公司，ISIS、PE等公司均投入大量精力从事开发研究；根据其与DNA优良的杂交稳定性，PNA又被广泛用于DNA分子识别和操纵。

尽管反义PNA具有特异性强、稳定性好等特点，并可能在基因的复制、转录和翻译等环节上抑制或下调靶基因的表达，达到治疗疾病的目的，但目前存在的问题是作为药用PNA不易进入细胞，进一步提高组织和细胞对反义PNA的摄人量及反义PNA进入细胞核一直是影响其广泛应用于临床的关键问题。

超声造影技术的不断发展和可携带基因的微泡声学造影剂的研制，使得超声已经从一种临床诊断工具，进入到治疗领域。将二者结合起来用于肿瘤或心血管疾病等的治疗，为这些患者提供一条安全、高效的治疗途径。微泡造影剂联合诊断超声介导基因靶向传输，是一种新型、无创、高效、简便易普及的技术。超声触发破坏微泡方法被认为可作为特定器官的靶基因治疗手段。其基本原理为：(1)超声造影剂是基因的良好载体，与病毒载体相比，造影剂微泡有更大的容量，可携带反义寡核苷酸，任意片断DNA，乃至整个染色体。(2)造影剂降低了超声的空化域值，超声照射可在特定空间(聚焦区)和特定时间破坏造影剂微泡，产生空化效应和声化学效应，使周围靶细胞(包括血管内皮细胞和组织细胞)细胞间隙增宽，膜通透性增大，细胞表面一过性小孔形成(声孔效应)，同时微泡破裂时产生的冲击波，微声流作为一种驱动力量，促使从微泡上释放出来的基因通过破裂的微血管和内皮细胞间隙进入靶细胞。

由于PNA是水溶性，进入细胞较难，以往人们采用脂质体末段标记方法将其带入细胞，但细胞摄入量有限，在体较难发挥作用；应用高效脂质体如阳离子脂质体等可能产生细胞毒性。