[发明专利]一种固定化蛋白酶试剂的制备及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种固定化蛋白酶试剂的制备及其应用。

背景技术

作为后基因组时代的重点研究领域，蛋白质组学研究不仅能为生命活动规律的阐明提供理论基础，也能在疾病的诊断、治疗、预防、致病病原发病机制以及新药开发等方面发挥作用。自2001年被“科学”杂志评为21世纪的六大热点研究领域后，蛋白质组学研究受到了科学家的广泛关注。目前应用最为广泛蛋白质组学研究策略是“鸟枪法”（shot-gun method）策略。这一策略中，蛋白质的定性和定量信息是通过对相应的酶解产物肽段进行分析所获得，因此快速、高效、完全的蛋白质酶解就成了蛋白质组准确、高通量鉴定以及定量研究中极其重要的环节。然而，传统的溶液酶解中为了避免蛋白酶自身酶解，往往须使用较低的蛋白酶与底物蛋白质比例（蛋白酶：蛋白质底物=1:50），因此酶解反应通常需要较长的孵育时间（12-20小时），而且对于高度复杂的样品难以实现完全酶解，因而限制了样本的分析通量，蛋白质鉴定的灵敏度和定量研究的准确度，无法满足蛋白组学大规模、高通量分析的要求。

基于以上原因，发展快速、高效的蛋白质酶解技术，对于复杂蛋白质组样品的鉴定是十分必要的。固定化酶技术避免了蛋白酶自身酶解的问题，因此可使用更高的酶/底物比，从而大幅度加快了酶解反应的进程，同时具有可回收并重复使用等诸多优点.在众多的固定化酶载体材料，如二氧化硅微球，聚合物膜，整体柱材料，介孔材料基质中（Xu,F.et al.Anal.Chem.2010,82,10045-10051.Spross,J.et al.Anal.Chem.2010,82,1434-1443.Qian,K.et al.Anal.Chem.2009,81,5749-5756.），磁性纳米颗粒因为其较大的比表面积以及易于实现磁性分离等特性凸显优势（Lin,S.et al.J.Proteome Res.2008,7,1297-1307.）。但目前普遍采用的在基体材料表面进行单层酶固定的方法，使单位质量固定化酶材料的酶固载量受到基体材料表面积的限制，因而限制了酶解效率的进一步提高。同时现有的固定化酶试剂均采用单一载体材料，不可避免载体本身对蛋白质的亲和性差异所引发的酶解偏性，导致蛋白质酶解不够全面，影响了蛋白质和肽段鉴定的覆盖率。

原子转移自由基聚合法(Atom Transfer Radical Polymerization,ATRP)是MatyjaszewkiK.教授小组于1995年首次提出的一种可控自由基聚合方法。十余年以来得到了国际学术界和工业界的广泛关注。ATRP方法具有产物聚合物结构可控性好、分子量分布窄、适用单体范围广、反应条件要求适中等特点。表面引发原子转移自由基聚合法(SI-ATRP)是将ATRP引发剂固定于材料表面后原位引发聚合物生长的一种方法，现已广泛应用于材料的表面修饰与功能化。

发明内容

本发明的目的是提供一种固定化蛋白酶试剂的制备及其应用。

本发明提供的一种固定化酶，该固定化酶由疏水性载体材料和固定在所述疏水性载体材料上的蛋白酶组成；

所述疏水性载体材料为疏水性单体在带有表面引发原子转移自由基聚合引发剂的颗粒的表面发生原子转移自由基聚合而得到的产物；其中，所述疏水性单体聚合成聚合链；所述疏水性单体聚合而成的聚合链与所述颗粒通过C-Si-O键连接；

所述蛋白酶与所述疏水性载体材料上的聚合链通过碳氮键链接。

上述固定化酶中，所述颗粒为磁性纳米颗粒；

所述磁性纳米颗粒具体为二氧化硅包裹的磁性纳米颗粒；

所述带有表面引发原子转移自由基聚合引发剂的颗粒为将表面引发原子转移自由基聚合引发剂固定连接在所述颗粒的表面制成；

所述表面引发原子转移自由基聚合引发剂的一端为能与硅羟基结合的偶联剂，另一端为原子转移自由基聚合引发剂；

所述疏水性单体为含有环氧基的缩水甘油酯类单体，具体为甲基丙烯酸缩水甘油酯；

所述蛋白酶具体为胰蛋白酶、蛋白内切酶、胞内蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。

上述任一所述的固定化酶中，所述固定连接的方法为所述表面引发原子转移自由基聚合引发剂与所述颗粒表面的硅羟基发生脱水反应生成硅氧键共价连接；

所述偶联剂为硅烷偶联剂；

所述硅烷偶联剂具体为3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷或γ-巯丙基三乙氧基硅烷；

所述原子转移自由基聚合的引发剂为2-溴异丁酰溴、α-溴代异戊酰溴或α-溴丙酰溴；

所述硅烷偶联剂与所述原子转移自由基聚合引发剂由酰胺键连接。