[发明专利]兰州大尾羊PPARG基因的克隆和原核表达载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物分子生物学领域,具体涉及一种兰州大尾羊PPARG基因的克隆和原核表达载体的构建方法。 

背景技术

过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)是调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员，主要表达于免疫系统和脂肪组织，是胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类药物作用的靶分子，与机体免疫、胰岛素抵抗、脂肪细胞分化关系密切。PPAR按结构分为α、β、γ三种类型，PPARG基因（γ型）是脂肪细胞分化的主要候选基因。 

1990年Issemann等首先发现这种脂肪酸样化合物，因其能被过氧化物酶体增殖剂(peroxisome proliferators,PP)激活而被命名为PP激活受体。1997年，Lehmann MJ等研究发现，PPARG在脂肪、巨噬细胞、肝、肾、肺、直肠中均有表达。哺乳动物中，PPARG在脂肪组织中表达量最高，其次为肝脏和肌肉。 

以往的研究认为脂肪细胞数量在动物出生时就已固定不变，脂肪沉积只是其体积肥大的过程。但目前研究表明脂肪细胞的分化贯穿于机体的整个生命过程，表现在两个方面，一方面是正常脂肪细胞的更新，另一方面是机体需要储备更多能量时导致脂肪细胞的分化。Chuang S研究表明，ERK（extra-cellular signal regulated protein kinase）信号通路可以诱导白细胞介素表达，使其下游PPARG被磷酸化，导致PPARG下游生脂相关的靶基因表达水平降低，从而抑制了脂肪细胞分化。2011年，Pachakkil研究表明，香草精通过激活ERK 通路，上调了前体脂肪细胞中PPARG基因的表达，增加了细胞葡萄糖的摄取量，促进了脂肪细胞分化。所以，PPARG基因是脂肪代谢过程中，尤其是在脂肪细胞分化过程中起重要作用。 

兰州大尾羊是清朝同治年间由陕西大荔一带引进的同羊与兰州当地蒙古羊杂交选育而成的地方绵羊品种，具有耐粗饲、抗病能力强、饲料利用率高、适应性强、肉质鲜美等优点的优良地方绵羊品种，因其尾部脂肪过度沉积，导致尾大、脂肪充实而得名，其尾部脂肪细胞分化与其它绵羊差异显著，但是，国内外目前对于兰州大尾羊脂肪细胞分化相关基因的研究甚少，PPARG基因研究未见报道。 

因此，本发明利用RACE技术获得兰州大尾羊PPARG基因全长cDNA序列，进一步构建原核表达载体，获得重组PPARG蛋白，进一步研究PPARG基因的结构和功能，以及对绵羊脂肪细胞分化过程中的作用。 

发明内容

本发明提供兰州大尾羊PPARG基因全长cDNA序列，并构建原核表达载体获得重组PPARG蛋白，研究它的结构与功能以及对绵羊脂肪细胞分化过程中的作用。 

兰州大尾羊PPARG基因是一种调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员，与脂肪细胞分化密切相关的基因，其cDNA序列全长1774bp，其CDS区片段长1428bp，编码475个氨基酸，首次提供绵羊编码区两侧翼，分别具有5’-UTR131bp（1-131nt）和3’-UTR214bp（1560-1774nt）。 

本发明进一步提供构建绵羊PPARG基因原核表达载体并获得重组PPARG蛋白的方法。 

更具体的，本发明提供一种兰州大尾羊PPARG基因的全长cDNA，如SEQ ID NO：7所示。 

更具体的，本发明提供一种兰州大尾羊PPARG基因全长cDNA的编码蛋白，如SEQ ID NO：8所示。 

更具体的，本发明提供一种表达载体，包含上述的兰州大尾羊PPARG基因的全长cDNA。 

更具体的，本发明提供兰州大尾羊PPARG基因全长cDNA的用途，用于绵羊前体脂肪细胞的诱导分化。 

附图说明

图1：PPARG基因5’-RACE片段、3’-RACE片段和CDS片段扩增产物电泳图 

M1.DL2000DNAmarker;M2.1500bp DNAmarker;1.5’-RACE cDNA片段;2.3’-RACE cDNA片段.;3.CDS片段. 

图2PPARG基因同源性分析和系统发育树 

左图：PPARG基因同源性分析结果；右图：PPARG基因系统发育树 

图3兰州大尾羊与其他物种PPARG基因序列间多序列对位排列 

黑色部分表示氨基酸序列完全相同；红色部分表示有一个以上氨基酸序列不同。 

图4重组质粒pET-32a（+）-PPARG的酶切鉴定