[发明专利]基于DNA条形码的鳗鱼物种鉴别方法

说明书

技术领域

 本发明涉及一种基于DNA条形码的鳗鱼物种鉴别方法，更具体涉及一种基于DNA条形码的日本鳗(Anguilla japonica)、美洲鳗(Anguilla rostrata)和欧洲鳗(Anguilla anguilla)的物种鉴别方法。

背景技术

福建省是鳗鱼养殖与加工出口大省，主要产品有三种鳗鱼，即日本鳗(Anguilla japonica)、美洲鳗(Anguilla rostrata)、欧洲鳗(Anguilla anguilla)，每年出口额达数十亿元。由于鳗鱼加工如烧烤或制成其他形状熟食后，无法从形态上辨别其种类，不同种类的鳗鱼价格不同。为了防止以次充好，保护企业与消费者利益，应企业与执法部门要求，建立鳗鱼种类的生物鉴定方法。本发明是应对外经贸与检验检疫工作的需要，对作为鳗鱼出口大省的福建省的对外贸易具有重要意义。

DNA条形码（DNA barcode）是指生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。DNA条形码已经成为生态学研究的重要工具，不仅用于物种鉴定，同时也帮助生物学家进一步了解生态系统内发生的相互作用。但是目前国内外尚无利用DNA 条形码鉴定鳗鱼物种的报道。

发明内容

基于上述目的，本发明提供了一种基于DNA条形码的鳗鱼物种鉴别方法。

本发明首先提供了一种日本鳗、美洲鳗和欧洲鳗的DNA条形码引物，DNA条形码目的片段的PCR产物碱基数为244 bp，所述DNA条形码引物的核苷酸序列为：

EEL 244-F： CCTGTTCC TCGTGGGGGC TTTT；

EEL 244-R： ATGGCATAACGAGGGTTTAACTG。

本发明通过对供试的日本鳗、美洲鳗和欧洲鳗的DNA条形码目的片段的PCR产物碱基序列进行比对分析，确定3种鳗鱼各自的特异性DNA条形码碱基序列，建立鳗鱼物种的分子生物学鉴别方法。本发明的基于DNA条形码的鳗鱼物种鉴别方法，该方法包括以下步骤：

（1）鳗鱼DNA提取；

（2）利用DNA条形码引物进行PCR扩增，扩增出244 bp的产物，所述DNA条形码引物为EEL 244-F： CCTGTTCC TCGTGGGGGC TTTT， EEL 244-R： ATGGCATAACGAGGGTTTAACTG；

（3）进行物种鉴别的序列特征比对，其中，是按下表所示的核苷酸序列特征变异位点进行物种鉴别：

。

步骤（2）所述PCR扩增的条件为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，45℃退火30 s，72℃延伸60 s，5个循环；94℃变性30 s，51℃退火60 s，72℃延伸60 s，35个循环；72℃延伸10 min；反应体系为：10 × Taq buffer 2.5 μL，Taq酶1.0 U，模板DNA 200 ng，MgCl₂ 3.5 mmol/L，dNTPs 300 μmol/L，上游引物0.5 μmol/L，下游引物0.5 μmol/L，用ddH₂O将总体积补至25μL。

本发明的方法用于特异性地鉴别出三种鳗鱼日本鳗(Anguilla japonica)、美洲鳗(Anguilla rostrata)、欧洲鳗(Anguilla anguilla)的种类，该方法耗时短，操作简便，特异性强，可以鉴别经过加工的、无法从形态学上加以识别的蒲烧鳗鱼等鳗鱼常见加工产品，为维护企业与消费者利益以及正常的市场秩序提供技术支撑。

附图说明

图1为3种鳗鱼PCR扩增产物图谱，其中M:DNA Marker; 1.日本鳗鱼(Anguilla japonica)；2.美洲鳗鱼(Anguilla rostrata)；3.欧洲鳗鱼(Anguilla anguilla)。

图2为3种鳗鱼16S rDNA部分片段特异性碱基序列比对图，其中，下划线部分为引物序列，框内加粗字体为3个鳗鱼种类特异性碱基序列，即从正向引物第一个碱基C起第104-106号碱基序列为：日本鳗鱼AAC,美洲鳗鱼GTT,欧洲鳗鱼GGT。

具体实施方式