[发明专利]基于AllGlo探针荧光定量PCR的microRNA检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.检测miRNA的特异引物，其特征在于包括特异的逆转录引物和特异的正向引物；

所述特异的逆转录引物是指在核苷酸序列为SEQ ID NO.1 5＇-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC5＇-末端加上与miRNA序列3＇端8个反向互补的碱基；

所述特异的正向引物是指在miRNA的碱基序列去掉3＇端8个碱基，同时在5＇端加上6个碱基序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2 5＇-TCCCTC-3＇。

2.基于AllGlo探针荧光定量PCR的microRNA检测试剂盒，其特征在于设有盒体、隔板、miRNA提取试剂瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶；隔板设在盒体内，miRNA提取试剂瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶插在隔板上，miRNA提取试剂瓶内装有miRNA提取试剂，茎环逆转录试剂瓶内装有茎环逆转录试剂，实时荧光定量PCR试剂瓶内装有实时荧光定量PCR试剂。

3.如权利要求2所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的microRNA检测试剂盒，其特征在于所述miRNA提取试剂包括外源性参照cel-miR-39，其工作浓度为5n mol；所述cel-miR-39的核苷酸序列为SEQ ID NO.3 5＇-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3＇。

4.如权利要求2所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的microRNA检测试剂盒，其特征在于所述茎环逆转录试剂包括以下组份：200单位/μL的MMLV酶、10m moldNTP混合液、5×RT缓冲液、40单位/μL的RNA酶抑制剂、10m mol的MgCl₂、1μmol的特异的miRNA的逆转录引物、miRNA标准品，浓度为100n mol；

所述特异的miRNA的逆转录引物是指在核苷酸序列为SEQ ID NO.1 5＇-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC-5＇末端加上与miRNA序列3＇端8个反向互补的碱基；所述5×RT缓冲液由250m mol Tris-HCl，375m mol KCl，15m mol MgCl₂，50m mol DTT组成。

5.如权利要求2所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的microRNA检测试剂盒，其特征在于所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份：10×Taq缓冲液、10m mol的MgCl₂、5单位/μL的Taq聚合酶、10mM dNTP混合液、100ml无核酶水、10μmol特异正向引物、10μmol通用反向引物和AllGlo探针；所述特异正向引物为在miRNA的碱基序列去掉3＇端8个碱基，同时在5＇端加上6个碱基序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2 5＇-TCCCTC-3＇；所述通用反向引物为SEQ ID NO.4 5＇-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3＇；所述AllGlo探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO.5MAR-CACTGGATACGACGCTGCCG-MAR；所述10×Taq缓冲液包括100m mol Tris-HCl，500m mol KCl。

6.基于AllGlo探针荧光定量PCR的microRNA检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）采用常规方法提取样本中miRNA，若为血清/血浆或其他体液样本，则在200μL样本充分裂解后加入基于AllGlo探针荧光定量PCR的miRNA检测试剂盒提供的浓度为5n mol的外源性参照cel-miR-39 5μL，立即漩涡震荡15s；若为细胞或组织样本，则无需加入外源性参照cel-miR-39；

2）应用基于AllGlo探针荧光定量PCR的miRNA检测试剂盒提供的茎环逆转录试剂将miRNA逆转录为cDNA;

3）应用基于AllGlo探针荧光定量PCR的miRNA检测试剂盒提供的实时荧光定量PCR试剂将cDNA进行实时荧光定量PCR扩增；

4）综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值和基线，进行结果分析。

7.如权利要求6所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的microRNA检测方法，其特征在于所述AllGlo探针采用美国A1leLogic Biosciences Corporation公司的荧光定量探针。