[发明专利]一种基于数字PCR平台检测基因点突变的方法和试剂盒

权利要求书

1.一种基于数字PCR平台检测基因点突变的方法，其特征在于，

（1）数字PCR混合液制备：将待测的DNA模板、PCR引物、TaqMan探针以及PCR预混液混合，制备得到数字PCR混合液；

所述的TaqMan探针包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针，或者，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针；所述与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，且两者所含的荧光基团不同；

（2）用数字PCR混合液制作PCR微反应液滴，再进行PCR扩增反应；

PCR扩增条件为：93～97℃预变性3～15分钟；93～97℃变性5～50秒，65～75℃退火5～50秒，55～65℃延伸10～65秒，共进行20～60个循环，2～10℃终止反应；

（3）信号收集与结果判断：对PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号的类型判断待测样品中是否含有点突变的DNA模板及其数量和含量。

2.权利要求1所述基于数字PCR平台检测基因点突变的T方法其特征在于，所述荧光基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-羧基荧光素、Cy5、Cy3或VIC，猝灭基团选自6-羧基四甲基若丹明、BHQ1、BHQ2或MGB。

3.权利要求1所述基于数字PCR平台检测基因点突变的T方法其特征在于，所述的TaqMan探针由与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针组成。

4.权利要求1所述基于数字PCR平台检测基因点突变的T方法其特征在于，PCR扩增条件为，93.5～95℃预变性3～6分钟；93.5～95℃变性8～15秒，64.5～66℃退火8～15秒，55～57℃延伸40～50秒，共进行30～35个循环，6～10℃终止反应。

5.权利要求1所述基于数字PCR平台检测基因点突变的T方法其特征在于，PCR扩增条件为，94℃预变性5分钟；94℃变性10秒，65℃退火10秒，56℃延伸45秒，共进行32个循环，10℃终止反应。

6.权利要求1所述基于数字PCR平台检测基因点突变的T方法其特征在于，数字PCR混合液中所含的DNA模板、PCR引物及TaqMan探针的含量如下：

a.DNA模板，含量为0.25～1ng/μL；

b.PCR引物，包括正向引物和反向引物，含量分别为500～700nM；

c.TaqMan探针，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针，含量为200～400nM；或者，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针，含量分别为200～400nM。

7.权利要求1所述基于数字PCR平台检测基因点突变的T方法其特征在于，数字PCR混合液中所含的DNA模板、PCR引物及TaqMan探针的含量如下：

a.DNA模板，含量为0.5ng/μL；

b.PCR引物，包括正向引物和反向引物，含量分别为600nM；

c.TaqMan探针，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针，含量为300nM；或者，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针，含量分别为300nM。

8.TaqMan探针用于制备基于数字PCR平台检测基因点突变的试剂盒，其特征在于，所述的TaqMan探针包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针，含量为200～400nM；或者，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针。

9.TaqMan探针用于基于数字PCR平台检测基因点突变，其特征在于，所述的TaqMan探针包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针，含量为200～400nM；或者，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针。

10.一种基于数字PCR平台检测基因点突变的试剂盒，其特征在于，包含以下物质：

（1）与突变型DNA模板结合的TaqMan探针；

（2）与野生DNA模板结合的TaqMan探针；

且上述两种TaqMan探针均为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，所含的荧光基团类型不同。