[发明专利]一种人尿中检测香草扁桃酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学检测领域，尤其是一种人尿中检测香草扁桃酸的方法。

背景技术

儿茶酚胺是由肾上腺髓质分泌的一类激素，其中包括了多巴胺、肾上腺素和去肾上腺素。这些激素往往因为物理或精神上的应激反应，被释放到血液循环中，提高大脑神经冲动传递，释放葡萄糖和脂肪酸以提供能量，支气管扩张和瞳孔放大。大多数儿茶酚胺会被代谢降解成为香草扁桃酸(Vanilmandelic acid，VMA)、高香草酸(homovanillic acid，HVA)、变肾上腺素(metanephrine)和去甲肾上腺素(normetanephrine)，只有少量儿茶酚胺随尿排出体外。

VMA又名3-甲氧基-4-羟基扁桃酸或4-羟基-3-甲氧基苦杏仁酸，是一种儿茶酚胺类肾上腺素和去肾上腺素的代谢产物，最终随尿排出体外。VMA在尿样中的含量非常稳定，只有发生应激反应后含量才会略有增加。但是神经母细胞瘤(neuroblastomas)，嗜铬细胞瘤(pheochromocytomas)和其他的神经内分泌肿瘤(neuroendocrine tumors)能够大量产生儿茶酚胺，引起VMA含量的剧增。由于大量儿茶酚胺进入血液循环，使血管收缩，末梢阻力增加，心率加快，血压出现阵发性急骤升高。这些病人的临床表现为持续性高血压、心悸、恶心呕吐、气短、胸部压抑、头痛、手足发麻、大量出汗、视力模糊等，严重者可能出现脑溢血或肺水肿等高血压危象。尿VMA含量过高是儿茶酚胺分泌异常的一个重要标志，是诊断神经母细胞瘤和嗜铬细胞瘤的首选标志物。

目前VMA的检测手法主要有比色-色谱联用技术、ELISA和HPLC法。

市售的VMA检测ELISA试剂盒普遍应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定VMA水平。ELISA试剂盒具有灵敏、快速特点，但缺点是稳定性不高，对操作人员的技术有较高要求。而且该类产品主要为国外进口，如Cloud-Clone Corp.(美国)、Biocompare(美国)、RDG(美国)、Eaglebio(美国)等，价格昂贵。由于抗体等核心技术为国外垄断，国内尚无自主研发产品，无法根本上降低试剂成本。

比色-色谱联用技术，目前国内批准的检测试剂盒为西班牙Biosystems S.A.生产的香草扁桃酸分析试剂盒(国食药监械(进)字2010第2402315号)，该方法采用阴离子交换树脂将尿液中的VMA吸附保存在树脂上，其他干扰物质则不能被保留而清楚，最后洗脱纯化VMA。再在碱性条件下VMA被氧化形成香草兰素，通过紫外分光比色法进行定量分析。该方法效率高，检测性好，缺点是该试剂盒为国外垄断产品，价格昂贵。

HPLC技术检测VMA被认为最有前途的VMA检测方法。其中电化学检测法的研究相当成熟，此外化学后修饰法(Taran)、色谱质谱联用技术(Faμler、Lionetto)和毛细管电泳技术检测法也纷纷建立。这些方法优点是灵敏度高、检测速度快，但是需要特殊仪器，价格昂贵，成本高，操作人员需要特别培训，难以广泛应用于临床。HPLC联合UV检测法鲜有报道，而UV检测器成本低，一般购置HPLC的同时都会配备UV检测器。

发明内容

本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种快速、高效、廉价的人尿中检测香草扁桃酸的方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案：这种人尿中检测香草扁桃酸的方法，其步骤包括：

1)取人尿液用HCl酸化，在-80℃条件下保存，尿液融化后用乙酸乙酯萃取、挥发，醋酸再溶解，可获得VMA粗提取物；

2)上述粗提取物经过HPLC分离，在UV检测器280nm波长下，获得稳定单一的VMA吸收峰，并通过外标法绘制VMA标准曲线，最终计算出VMA的含量。

作为优选，其中步骤1)具体如下：

a)收取新鲜尿液后，加入5M HCl酸化，放入-80℃冷柜中保存，直到开始后续实验；

b)待尿液融化后，取4ml尿液到一个预装有2g NaCl的15ml离心管内，上下颠倒混合10min形成饱和盐溶液；

c)加入4ml乙酸乙酯，上下颠倒混合5min；4000g离心5min，小心吸取上层有机相到一根新50ml圆底离心管内；

d)重复b-c步2次，获得上层有机相共12ml；

e)将离心管用金属加热器加热到45℃，在通风柜内高风挥发，直到所有的乙酸乙酯挥发完全，获得黄色或黑色沉淀；

f)加入400μl1％醋酸溶液，充分震荡，4℃过夜溶解；